牡蠣酶解產(chǎn)物改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的初步研究

林海生，曹文紅，盧虹玉，章超樺，呂妙兄，席 慶

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088)

牡蠣酶解產(chǎn)物改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的初步研究

林海生，曹文紅，盧虹玉，章超樺*，呂妙兄，席 慶

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088)

探討了牡蠣酶解產(chǎn)物對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。選用中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶和復(fù)合酶分別水解牡蠣蛋白得到EHO1、EHO2和EHO3，分析其基本營(yíng)養(yǎng)成分和分子量分布;采用Morris水迷宮行為學(xué)方法考察EHO對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善能力。結(jié)果顯示，EHO含有豐富的肽、糖原、?；撬?，分子量在主要集中在1300～10000u之間;定位航行測(cè)試顯示，相對(duì)于空白組，EHO干預(yù)后小鼠的潛伏期都明顯的縮短，空間搜索策略的比例明顯提高，EHO3組效果最好，潛伏期(16.77±7.74)s(p＜0.05)，空間搜索的比例為85.71%;而空間探索實(shí)驗(yàn)中，給藥組小鼠的穿越次數(shù)、中央活動(dòng)時(shí)間和目標(biāo)象限路程比都有不同程度的增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的EHO能夠提高小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

牡蠣酶解物，Morris水迷宮，學(xué)習(xí)記憶

近江牡蠣(Ostrea rivularis)又名海蠣子、蠔等，廣泛分布在我國(guó)南北沿海，是我國(guó)主要經(jīng)濟(jì)貝之一。廣東沿海對(duì)近江牡蠣的養(yǎng)殖歷史悠久，資源十分豐富。牡蠣含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖原和微量元素等，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，具有廣泛的生理活性，素有“海洋牛奶”“根之源”之美名，已被我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為第一批既是藥材又可作為食品保健品［1］。目前，國(guó)內(nèi)牡蠣以鮮食為主，牡蠣加工比例僅占10%左右，加工品中以制成干肉制品為主，少量加工成蠔油或其它調(diào)味品［2］。隨著牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，近江牡蠣的產(chǎn)量迅速增加，資源高值化利用及其深加工技術(shù)應(yīng)用對(duì)于牡蠣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。近些年研究發(fā)現(xiàn)牡蠣具有如抗癌、抗病毒、抗疲勞、抗氧化、降血糖、降血壓、降血脂、醒酒護(hù)肝等多種生物活性［3］。學(xué)習(xí)和記憶是大腦高級(jí)神經(jīng)功能之一，隨著環(huán)境惡化和人口老齡化進(jìn)程，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能衰退等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病率逐年升高，如老年癡呆癥 (Alzheimer’s disease，AD)、帕金森癥(Parkinson’s disease，PD)等，其影響因子主要有神經(jīng)肽及其他神經(jīng)遞質(zhì)［4］。由于其發(fā)病成因多、機(jī)制復(fù)雜，單純的西藥治療所取得的效果仍不盡人意，因而開(kāi)發(fā)天然營(yíng)養(yǎng)保健食品成為防治該類疾病的重要途徑。目前已有報(bào)道?；撬幔?］、微量元素［6］、中藥活性成分［7］、豬腦水解物［8］、β－乳球蛋白肽［9］等物質(zhì)具有改善增強(qiáng)記憶功能、延緩衰老和防治阿爾茨海默氏病的功能。本研究利用生物酶法制備牡蠣酶解物，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)考察牡蠣酶解物對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響，為進(jìn)一步深入研究牡蠣中增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的活性成分及功能因子奠定前期基礎(chǔ)，亦為開(kāi)發(fā)相關(guān)保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 購(gòu)自廣東省湛江市東風(fēng)市場(chǎng)，經(jīng)廣東海洋大學(xué)蔡英亞教授鑒定為近江牡蠣 (Ostrea rivularis);昆明種小鼠 體重18～22g，雌雄對(duì)半，廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證書(shū)SYXK(粵)。

Morris水迷宮動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng) 淮北生物儀器設(shè)備有限公司;HHS電熱恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;FJ－200組織勻漿器 上海標(biāo)本模型廠;FDu－1100冷凍干燥機(jī) TOKYO RIKAKIKAI; GL－10LMD高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司;AUW 120分析天平 日本 SHIMADZU; LC－20AT型LPLC分析柱為蛋白凝膠柱PROTEINPAK 60(WAT085250) 日本島津;LC－20AD型HPLC分析柱 hypersil ODS C18(120mm×4.0mm，5μm) 日本島津;中性蛋白酶(20萬(wàn)μ/g)、木瓜蛋白酶(20萬(wàn)μ/g)、動(dòng)物蛋白水解酶(20萬(wàn)μ/g) 廣西龐博生物科技有限公司;其他試劑 分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣酶解產(chǎn)物的制備［1］工藝如下:新鮮牡蠣→清洗瀝干→稱重加水(m/V=1∶1)→組織均漿→酶解→滅酶(100℃，10min)→離心(6000r/min，15min)→上清液(測(cè)定水解度)→低溫真空濃縮→冷凍干燥→淺黃色干粉，即牡蠣酶解產(chǎn)物(Enzymatic Hydrolysis of Oyster，以下簡(jiǎn)稱EHO)。

酶解條件:pH7.0，時(shí)間3.0h，水解溫度55℃，酶和底物比(E/S)2%，選用中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶、復(fù)合酶(中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1∶1∶1)對(duì)牡蠣進(jìn)行水解分別得到EHO1(中性蛋白酶酶解物)、EHO2(動(dòng)物蛋白酶酶解物)和EHO3(復(fù)合酶酶解物)。

1.2.2 水解度的測(cè)定［10］總氮測(cè)定:凱氏定氮法; α－氨基態(tài)氮含量測(cè)定:甲醛滴定法。

水解度 DH(%)=(水解液中 α－氨基氮含量－水解前α－氨基氮含量)/(原料總氮含量－水解前α－氨基氮)×100

1.2.3 基本成分測(cè)定 水分測(cè)定:GB5009.3－2010直接干燥法;粗脂肪測(cè)定:GB5009.6－2003索氏抽提法;粗蛋白測(cè)定:GB5009.5－2010凱氏定氮法測(cè)定總氮含量再乘以6.25;灰分測(cè)定:GB5009.4－2010;總糖測(cè)定:硫酸苯酚法;總肽含量測(cè)定:雙縮脲法［11］;?；撬岷繙y(cè)定:OPA柱前衍生高效液相色譜法［12］。

1.2.4 分子量分布測(cè)定 高效體積排阻色譜(HPSEC)法［13］。

1.2.5 動(dòng)物分組及飼養(yǎng) 小鼠共40只，適養(yǎng)3d后稱重，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分成4組:EHO1組、EHO2組、EHO3組和空白組，按照相同灌胃劑量5g/(kg·d)分別灌以 EHO1、EHO2、EHO3和蒸餾水［1］。EHO分別配制成一定濃度的水溶液，每10g小鼠體重灌0.2m L。每天上午9:00～10:00灌胃一次，連續(xù)30d后進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，期間小鼠自由進(jìn)食基礎(chǔ)鼠糧及飲水。

1.2.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)［14－15］定位航行:Morris水迷宮為一直徑1.2m、高0.5m圓桶，劃為四個(gè)象限，有一直徑10cm平臺(tái)固定于某一象限，控制水的高度剛好沒(méi)過(guò)平臺(tái)，水溫控制25℃。實(shí)驗(yàn)在當(dāng)天灌胃30m in后進(jìn)行，連續(xù)訓(xùn)練5d。先將小鼠放于水中平臺(tái)30s熟悉周圍環(huán)境，再分別將其從四個(gè)象限面向池壁放入水中，搜索時(shí)間設(shè)定為90s，其運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)錄像記錄于電腦中，由MWM視頻分析軟件分析得出小鼠的游泳路徑、找到站臺(tái)時(shí)間(潛伏期:s)、平均游泳速度及搜索策略。

空間探索:用于測(cè)量動(dòng)物對(duì)平臺(tái)的空間位置的記憶能力。第6d撤掉平臺(tái)，在相同入水點(diǎn)(離平臺(tái)最遠(yuǎn)的象限)將鼠放入水中，搜索時(shí)間為90s，電腦錄像自動(dòng)記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，通過(guò)MWM視頻分析軟件計(jì)算出各組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、游泳總路程、中央活動(dòng)時(shí)間和目標(biāo)象限的路程比，綜合評(píng)價(jià)小鼠記憶保持能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 EHO基本成分及分子量分布

中性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶和復(fù)合酶酶解牡蠣蛋白的水解度(%)分別為14.95% ±0.80%、21.49% ± 2.73%和29.64%±3.32%。酶的水解能力具有專一性，不同的酶水解蛋白質(zhì)的肽鍵不同。多酶復(fù)合可以增加酶對(duì)蛋白質(zhì)分子的酶切位點(diǎn)，釋放出更多的肽片段及游離氨基酸，從而提高蛋白的水解能力。高翔等［16］在酶解利用龍蝦副產(chǎn)物中蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶解效果優(yōu)于單酶，不僅產(chǎn)品的水解效率提高，而且改善風(fēng)味，減低苦味。在本研究中選用的動(dòng)物蛋白酶屬于多酶系，因此其水解度也大于中性蛋白酶。

基本成分測(cè)試結(jié)果顯示(表1)，EHO的主要成分為蛋白質(zhì)(肽)、糖原。三種牡蠣酶解物中粗蛋白含量接近，約占70%，但其中水溶性總肽含量卻有所差別，EHO1＞EHO3＞EHO2;總糖和粗脂肪含量相差不遠(yuǎn)，分別約占14%和5%。同時(shí)含有豐富的牛磺酸，說(shuō)明EHO具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能。

以分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù) LgMW 為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程: LgMW=6.4972－0.2261 t，相關(guān)系數(shù)R=0.9877。圖1為牡蠣蛋白酶解物EHO1、EHO2和EHO3的HPLC圖，從圖中可以看出，三個(gè)樣品均含有5個(gè)主峰，但是相對(duì)于EHO1樣品(tA=8.08m in)，EHO2和EHO3樣品A峰(tA分別為8.55m in和8.58m in)較小且發(fā)生后移，其余4個(gè)峰的基本一致，可判斷 EHO2和EHO3的水解程度較大，分子量相對(duì)較大的肽類物質(zhì)比EHO1少。這結(jié)果與朱國(guó)萍等［13］在研究蝦頭自溶過(guò)程中發(fā)現(xiàn)隨著水解度增大，酶解物的峰形不斷向后推移的報(bào)道相一致，也與前面測(cè)得的總肽含量數(shù)據(jù)相吻合。根據(jù)回歸方程計(jì)算出各峰處對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果顯示，EHO1、EHO2和EHO3的分子量分別集中于206～46807、200～36648、206～36042u之間，其中分子量在1300～10000u左右的低分子肽分別占57.76%、58.29%和61.83%。

表1 EHO主要營(yíng)養(yǎng)成分含量(干粉)Table 1 Contents of themajor components in EHO

圖1 EHO的分子量分布圖Fig.1 Themolecular weight distribution of EHO

2.2 EHO改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的功能

2.2.1 Morris定位航行 經(jīng)過(guò)4d訓(xùn)練，小鼠尋找站臺(tái)的時(shí)間明顯縮短，說(shuō)明重復(fù)性MWM訓(xùn)練可以提高小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。最后一次定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EHO1組和EHO3組小鼠的潛伏期(分別為(17.82±9.43)、(16.77±7.74)s)顯著低于空白組(p＜0.05)，而EHO2組的潛伏期(20.85±3.77)s雖低于空白組，但沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)，如圖2所示。同時(shí)，相對(duì)于空白組，EHO3組小鼠的游泳速度顯著降低(p＜0.01)，而EHO1和EHO2組則沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)(圖2)。潛伏期是衡量小鼠空間學(xué)習(xí)能力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一，而游泳速度是小鼠運(yùn)動(dòng)能力的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EHO3組小鼠學(xué)習(xí)能力與游泳速度有一定的相關(guān)性，這可能與小鼠的情緒和應(yīng)激性有關(guān)，但游泳速度不能作為學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)弱的直接指標(biāo)［17］。

搜索策略是衡量動(dòng)物分析判斷能力和解決問(wèn)題能力的重要指標(biāo)，典型的四種搜索策略如圖3所示(ABCD圖)。學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中，小鼠的搜索策略隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加而呈現(xiàn)“邊緣式→隨機(jī)式→趨向式→直線式”的變化規(guī)律，學(xué)習(xí)記憶能力好的小鼠，其搜索策略以空間策略(趨向式和直線式)為主，相反則以邊緣式和隨機(jī)式為主［18］。搜索策略分析結(jié)果顯示(圖4)，與空白組相比，在EHO干預(yù)下的小鼠采用空間策略的比例均明顯提高。其中以EHO3組最為明顯，空間策略的比例占85.71%，而空白對(duì)照組僅占59%。采用直線式搜索策略比例最高亦為EHO3組，約占30%。

圖2 定位航行實(shí)驗(yàn)中EHO對(duì)潛伏期和游泳速度的影響Fig.2 Effect of EHO on the escape latency and the swimming speed in navigation test

綜上，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于空白組，EHO1組、EHO2組和EHO3組小鼠的潛伏期均有明顯的縮短，而采取空間搜索的比例都有明顯提高，其中EHO3組效果最好，潛伏期為(16.77±7.74)s，游泳速度為(14.61±3.71)cm/s，空間搜索的比例為85.71%。結(jié)果表明，EHO能夠提高小鼠空間學(xué)習(xí)能力。

圖3 典型的搜索策略和目標(biāo)探索游泳路徑圖Fig.3 Representative pictures of the swimming trails in MWM

表2 EHO對(duì)小鼠空間記憶保持能力的影響Table 2 Effect of EHO on the ability of spatialmemory

圖4 定位航行實(shí)驗(yàn)中小鼠空間搜索策略的分布Fig.4 Distribution of search strategies ofmice in place navigation test

2.2.2 Morris空間探索 空間探索測(cè)試結(jié)果顯示: EHO1組、EHO2組和EHO3組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均高于空白組，相反，其游泳經(jīng)過(guò)的總路程卻均有所縮短，但沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05);與空白組相比，EHO1組、EHO2組和EHO3組小鼠在中央活動(dòng)時(shí)間均有顯著性增加(p＜0.05)，EHO2組的時(shí)間最長(zhǎng)為(61.04±3.44)s(p＜0.05);同時(shí)EHO2組的目標(biāo)象限路程比為(28.192±2.99)%(p＜0.05)，顯著高于空白組，而EHO1組和EHO3組該指標(biāo)沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)(表2)。EHO2和空白組的游泳路徑如圖4(E圖和F圖)。

小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)是衡量小鼠對(duì)平臺(tái)空間位置學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)［19］。任建華等［20］評(píng)價(jià)小米和大豆為基料的嬰幼兒輔食改善小鼠記憶作用采用穿越平臺(tái)次數(shù)做指標(biāo)。而王維剛等人［21］在研究MWM實(shí)驗(yàn)方法中結(jié)合游泳總路程、中央活動(dòng)時(shí)間、目標(biāo)象限路程比等其他指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。從表2數(shù)據(jù)看出，EHO干預(yù)后小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、中央活動(dòng)時(shí)間及目標(biāo)象限路程比有不同程度的升高，行為學(xué)指標(biāo)表明EHO能夠提高小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的保持能力，其中以EHO2組效果最好。

綜上所述，EHO能夠提高實(shí)驗(yàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

3 結(jié)論

牡蠣具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和廣泛的生物活性，利用酶解技術(shù)是牡蠣資源精深加工的重要途徑。牡蠣蛋白酶解物含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性因子，如肽、糖原、?；撬岬?，分子量在主要集中在1300～10000u之間。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于空白組，EHO干預(yù)后小鼠的潛伏期均有明顯的縮短，而采取空間搜索的比例都有明顯提高，其中EHO3組最為顯著，潛伏期為(16.77±7.74)s(p＜0.05)，空間搜索的比例為85.71%;而空間探索實(shí)驗(yàn)中，給藥組小鼠的穿越次數(shù)、中央活動(dòng)時(shí)間和目標(biāo)象限時(shí)間比都有所增加，以EHO2組效果最好，穿越次數(shù)3.14±0.9，中央活動(dòng)時(shí)間為(61.04±3.44)s(p＜0.05)，目標(biāo)象限路程比為(28.19±2.99)%(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定劑量的EHO能夠提高小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。由于酶解產(chǎn)物成分較復(fù)雜，其改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的主要因子和作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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Prelim inary research on the function of enzymatic hydrolysis of oyster to im prove the learning and memory in m ice

LIN Hai－sheng，CAO W en－h(huán)ong，LU Hong－yu，ZHANG Chao－h(huán)ua*，LV M iao－xiong，XIQing
(Food Science and Technology Institute of Guangdong Ocean University，Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang 524088，China)

Investigation of the effec t of enzymatic hyd rolysis of oyster(EHO)on learning and memory ab ility.The contents ofmajor components and the molecular weight distribution of the EHO p repared respectively by adding neutrase，p roteolytic enzymes and m ixed enzymes were test，then the learning and memory ability were assessed using the Morris watermaze(MWM)w ith one controlgroup.The results showed that the EHO was rich in pep tide，glycogen and taurine，and the molecularweights were from 1300～10000u.MWM test indicated that the p roportion of spatial strategy of the treated g roups were higher and the escape latency were significantly shorter com pared to the control g roup.EHO3 group was the best one，the escape latency was(16.77±7.74)s(p＜0.05)and the p roportion of spatialstrategy reached 85.71%.All the three EHO g roups had more number of c rossings，longer time in the center and longer d istance in the target quad rant than that of control g roup in the spatial p robe test.These find ings suggested that certain amount of EHO could im p rove the learning and mem ory ab ility ofm ice.

enzym atic hyd rolysis of oyster;Morris waterm aze;learning and memory

TS218

A

1002－0306(2012)19－0341－05

2012－02－27 *通訊聯(lián)系人

林海生(1985－)，男，在讀研究生，研究方向:海洋生物資源利用。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS－48)。