柑橘皮中川陳皮素超聲提取工藝及含量分析

徐旭耀，王汝娟，謝偉飛

（湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048)

柑橘皮中川陳皮素超聲提取工藝及含量分析

徐旭耀，王汝娟，謝偉飛

（湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048)

以甲醇為提取溶劑，采用超聲波提取柑橘皮中川陳皮素，并用高效液相色譜進(jìn)行分析，結(jié)合單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波提取柑橘皮中川陳皮素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，探討不同因素對(duì)柑橘皮中川陳皮素提取含量的影響。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：90%甲醇、料液比1∶50（W/V）、提取溫度50℃、提取時(shí)間60min。用優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為90.5%，并用于幾樣柑橘皮中川陳皮素含量測(cè)定。結(jié)果表明，精品橙皮中川陳皮素的含量最高。

川陳皮素，柑橘皮，超聲提取，高效液相色譜（HPLC），檢測(cè)

柑橘為蕓香科植物，是世界上最重要的商品水果之一。柑橘果皮在醫(yī)學(xué)上稱陳皮，柑橘皮中除了含有豐富的芳香油、果膠、色素外，還含有橙皮苷、新橙皮苷、橘皮素、川陳皮素、二氫川陳皮等黃酮類化合物。黃酮類化合物是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類植物的次生代謝產(chǎn)物，作為一種功能成分，其主要作用有抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能、增強(qiáng)免疫力、調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)、護(hù)肝、抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、抗病毒等。根據(jù)近幾年國(guó)內(nèi)外對(duì)柑橘皮藥理作用的廣泛深入研究和臨床實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其中的黃酮類化合物起著非常重要的作用[1-3]。川陳皮素（nobiletin，NOB）又稱蜜橘黃酮，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，是從柑橘果皮中提取的一種多甲氧基黃酮類化合物。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)NOB具有廣譜抗腫瘤、抗血栓、抗真菌、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化活性等作用[4-6]。近年來(lái)，大量研究顯示NOB還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性[7]，可治療阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等神經(jīng)衰退性疾病[8-11]。川陳皮素富含于柑橘類水果果皮中，但不同品種柑橘果皮中川陳皮素含量不同。本文旨在研究柑橘果皮中川陳皮素的超聲提取工藝及含量測(cè)定，為柑橘果皮的綜合開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 川陳皮素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of nobiletin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川陳皮素對(duì)照品，含量≥98% 天津一方科技有限公司；石油醚 分析純；甲醇 色譜純；蒸餾水；柑橘 市售。

Waters510高效液相色譜儀 包括Waters 510高壓輸液泵兩臺(tái)，柱溫控制器（TCM），Waters 486紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器（可調(diào)波長(zhǎng)為190～600nm），Rheodyne77251手動(dòng)進(jìn)樣器，486計(jì)算機(jī)millennium 2010色譜工作站，Gemini C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；AE240雙量程分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；SB-3200型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技有限公司；微量移液管 熱電儀器有限公司；迷你振蕩器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Gemini C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水混合液；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：328nm；進(jìn)樣體積：20μL。對(duì)照品和樣品的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照品和樣品的川陳皮素HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of nobiletin in standard and sample solutions

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取川陳皮素1.93mg，加甲醇溶解，渦旋混合，定容于5mL容量瓶中，搖勻，即得386μg/mL川陳皮素對(duì)照品溶液，冷藏備用。

1.2.3 供試品溶液制備 將已烘干的新奇士柑橘皮用料理機(jī)破碎成粉末，經(jīng)石油醚超聲脫脂、脫色素，以排除干擾，揮盡石油醚，烘干粉末，置干燥器中備用。精密稱取該粉末0.2g，加入一定濃度的提取溶劑，經(jīng)超聲波清洗器超聲提取，過(guò)濾，定容，振蕩均勻后經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾得待測(cè)的供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相的選擇

川陳皮素的紫外最大吸收波長(zhǎng)為328nm[12]，以甲醇作為川陳皮素的流動(dòng)相，當(dāng)用100%甲醇做流動(dòng)相時(shí)，峰的保留時(shí)間太短，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定甲醇-水（59∶41）為流動(dòng)相比例，保留時(shí)間適中，峰形比較好。

2.2 校準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取一定體積的川陳皮素對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，按1.2.1的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以濃度c（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，川陳皮素在1.93～145μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，校準(zhǔn)曲線方程為：A=75144c-35902（r=0.9997）。

2.3 提取溶劑的選擇

精密稱取0.2g新奇士皮粉4份，分別以1∶40（g/mL）料液比的丙酮、無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯為溶劑超聲處理30min，過(guò)濾，并用相應(yīng)的溶劑定容，再用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液按1.2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，甲醇超聲提取較好。

2.4 提取條件的選擇

采用單因素實(shí)驗(yàn)，以新奇士皮粉中川陳皮素提取含量為考察指標(biāo)，平行稱取幾份樣品，分別考察料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、甲醇濃度四個(gè)因素對(duì)新奇士皮粉中川陳皮素提取含量的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取主要幾個(gè)水平，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)川陳皮素的最佳超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化選擇。

2.4.1 料液比的選擇 精密稱取樣品0.2g各5份，用濃度100%甲醇在25℃超聲45min，分別用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）料液比的甲醇進(jìn)行超聲提取，過(guò)濾，定容，在1.2.1色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，料液比為1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）對(duì)川陳皮素提取效果較好。

圖3 不同料液比對(duì)川陳皮素提取含量的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction content of nobiletin

2.4.2 超聲時(shí)間的選擇 精密稱取樣品0.2g各5份，按料液比1∶40（g/mL）用100%甲醇溶解，在25℃超聲30、45、60、75、90min，過(guò)濾，定容，在1.2.1色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，超聲時(shí)間60、75、90min對(duì)川陳皮素提取效果較好。

圖4 不同超聲時(shí)間對(duì)川陳皮素提取含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction content of nobiletin

2.4.3 超聲溫度的選擇 精密稱取樣品0.2g各4份，按料液比1∶40（g/mL）加入100%甲醇溶解，在30、40、50、60℃超聲45min，過(guò)濾，定容，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，超聲溫度為40、 50、60℃對(duì)川陳皮素的提取效果較好。

圖5 不同超聲溫度對(duì)川陳皮素提取含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction content of nobiletin

2.4.4 溶劑甲醇濃度的選擇 精密稱取樣品0.2g各5份，按料液比1∶40（g/mL），加入濃度為60%、70%、80%、90%、100%的甲醇，在25℃超聲45min，過(guò)濾，定容，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，濃度為70%、80%、90%的甲醇對(duì)川陳皮素的提取效果較好。

圖6 不同甲醇濃度對(duì)川陳皮素提取含量的影響Fig.6 Effect of methanol concentration on the extraction content of nobiletin

2.4.5 正交實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取每個(gè)影響因素的主要幾個(gè)水平，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，優(yōu)化料液比、提取時(shí)間、提取溫度、甲醇濃度四個(gè)因素，確定最佳提取工藝條件。正交設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 川陳皮素正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment of nobiletin

由表2可知，溫度對(duì)川陳皮素提取含量影響最大，其次是料液比和時(shí)間，最后是甲醇濃度。從方差分析結(jié)果來(lái)看，溫度對(duì)川陳皮素的提取含量影響非常顯著，料液比對(duì)提取含量的影響顯著。由極差和方差分析綜合得出，超聲提取新奇士皮粉中川陳皮素的最佳工藝條件是：A2B1C2D3，即料液比為1∶50（g/mL），超聲時(shí)間為60min，超聲溫度為50℃，甲醇濃度為90%，這剛好和實(shí)驗(yàn)號(hào)4的結(jié)果吻合，這一結(jié)果已經(jīng)出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)方案中，驗(yàn)證了A2B1C2D3是最優(yōu)方案。

表2 川陳皮素正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment method and results of nobiletin

表3 柑橘皮中川陳皮素提取含量的方差分析表Table 3 Analysis of variance table of nobiletin extraction content in citrus peels

2.5 進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn)

同一供試樣品溶液，在1.2.1色譜條件下連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20μL，測(cè)定川陳皮素吸收峰面積并計(jì)算得RSD為1.88%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精確稱取同一批次樣品0.2g各4份，按照最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行超聲波處理，過(guò)濾，定容，在1.2.1色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，并計(jì)算得到川陳皮素峰面積的RSD為1.70%，表明測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知含量的樣品0.2g共4份，分別加入川陳皮素對(duì)照品適量，按上述最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方案制備供試品溶液，得到川陳皮素平均回收率為90.5%，RSD為1.98%。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 川陳皮素回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The recovery experiment result of nobiletin

2.8 樣品測(cè)定

按上述最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案處理，測(cè)定5樣柑橘皮樣品，結(jié)果如表5。由表5可知，川陳皮素在5樣柑橘果皮中的含量為：精品橙>蜜柑>巴西柑>胡柚>檸檬。

表5 幾樣柑橘皮中川陳皮素提取含量比較（以干重計(jì)）Table 5 Comparison among nobiletin content in several citrus peels

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲提取柑橘皮中川陳皮素的工藝條件及含量進(jìn)行研究。對(duì)超聲提取中的料液比、時(shí)間、溫度、甲醇濃度進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)并采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，以高效液相色譜對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明，超聲提取柑橘皮中川陳皮素的最佳工藝條件為：料液比1∶50（g/mL），超聲時(shí)間60min，提取溫度50℃，甲醇濃度為90%，平均加標(biāo)回收率為90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.98%，說(shuō)明方法穩(wěn)定可靠，結(jié)果比較準(zhǔn)確。在幾種柑橘皮中精品橙的川陳皮素含量最高。

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Study on ultrasonic-assisted extraction of nobiletin from citrus peels and analysis of nobiletin content in several citrus samples

XU Xu-yao，WANG Ru-juan，XIE Wei-fei
（Chemistry Science and Technology School，Zhanjiang Normal University，Zhanjiang 524048，China）

With methanol as extraction solvent，the nobiletin from citrus peels which was extracted by ultrasonic assistance was determinated by HPLC，and the ultrasonic extracted process was optimized by single factor and orthogonal tests.The influences of different factors on the extraction content of nobiletin in citrus peels were studied.The results showed that the optimum extraction condition was：90%methanol，ratio of material to liquid 1∶50（W/V），extraction temperature 50℃，and extraction time 60min.The recovery was reached to 90.5%with the optimum condition which was used in the content determination of nobiletin from several citrus peels.The results showed that the nobiletin content in jingpin orange peels was higher than others.

nobiletin；citrus peel；ultrasonic extraction；high performance liquid chromatography（HPLC）；determination

TS201.2

B

1002-0306（2012）09-0301-04

2011－06－20

徐旭耀（1982-），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品分析與檢測(cè)。