甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白對人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪分化的影響*

楊玉嘉，張 凱，白 雪，王 毅

(天津市天津醫(yī)院，天津 300211)

PTHrP最初是從引起高鈣血癥的惡性腫瘤組織中分離出來，其與甲狀旁腺激素在編碼基因、分子結(jié)構(gòu)和受體功能上有許多相同或相似之處［1］。但PTHrP促進(jìn)骨合成代謝的分子機(jī)制尚未十分清楚，還須作進(jìn)一步研究。本實驗分析了PTHrP(1－86)作用于人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)后其脂肪特異性基因脂蛋白脂肪酶(LPL)的表達(dá)，以進(jìn)一步闡述其對基質(zhì)細(xì)胞分化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 骨髓來源 5份骨髓標(biāo)本均來源于本院創(chuàng)傷性股骨頭置換手術(shù)患者，其中男3例，女2例，年齡37～45歲，已確診供者無骨代謝疾病，無急、慢性感染且均經(jīng)本人同意。

1.1.2 主要試劑和儀器 PTHrP(PeproTech公司，美國)，DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco BRL公司)，淋巴細(xì)胞分離液、胰島素、地塞米松、β－甘油磷酸鈉(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，MTT(Sigma公司)，α萘酚磷酸鹽(Koch－Light Laboratories Ltd)，1%蘇丹紅染色液(蘇丹紅IV 1 g溶入體積分?jǐn)?shù)為0.7乙醇溶液中過濾備用)，逆轉(zhuǎn)錄和RT－PCR試劑盒(TaKaRa，寶生物工程有限公司)，酶聯(lián)免疫測定儀(MRXⅡ，美國Dynex)，定量PCR儀(ABI 7300，美國)。

1.2 方法

1.2.1 hMSCs的分離培養(yǎng)及分組 分別無菌抽取各患者骨髓5～10 ml，采用淋巴細(xì)胞分離液分離法，取單個核細(xì)胞層，DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2次，沉淀物用含10%FBS－DMEM/F12培養(yǎng)液混懸，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、95%飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)hBMSCs生長融合達(dá)80%左右，用0.25%胰酶消化傳代細(xì)胞，取第3代細(xì)胞用于實驗。將每個樣本的實驗細(xì)胞分為三組:對照組，采用10%FBS－DMEM/F12培養(yǎng);成脂誘導(dǎo)組，采用成脂誘導(dǎo)液(含1×10－8mol/L地塞米松、10mg/L胰島素的10%FBS－DMEM/F12［2］)培養(yǎng);成脂 +PTHrP 組，采用成脂誘導(dǎo)液 +40 nMPTHrP培養(yǎng)。每48 h換液1次。

1.2.2 對細(xì)胞生長增殖的影響 分別取各組的第3代細(xì)胞按5×104/ml濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每48 h換液1次，采用MTT法分別檢測各組第2、4、6、8 d時的細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 成脂蘇丹紅 IV染色 第3代細(xì)胞按1×105/ml濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片上，每48 h換液1次，于第10、14、21日時分別對各組進(jìn)行蘇丹紅IV染色。

1.2.4 對 LPL表達(dá)的影響 第3代細(xì)胞按1×105/ml濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的蓋玻片上，每48 h換液1 次，分別于第3、5、10、21 日時以 TRIZOL 試劑提取細(xì)胞總RNA并測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green PCR試劑盒于熒光定量檢測儀進(jìn)行相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增:95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 31 s，共40個循環(huán)。用每個樣本的Ct值采用2－ΔΔt方法計算mRNA的相對表達(dá)量。各基因的引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，計量資料多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗各組細(xì)胞增殖水平的比較 成脂誘導(dǎo)組、成脂+PTHrP組細(xì)胞增殖均顯著高于對照組(P＜0.01);成脂誘導(dǎo)組比成脂+PTHrP組，前期無顯著性差異，從第4日起前組顯著高于后組(P＜0.05)，見表2。

2.2 實驗各組成脂蘇丹紅IV染色 第7日時成脂誘導(dǎo)組的蘇丹紅IV染色開始出現(xiàn)少量細(xì)小紅色脂滴，14日時細(xì)小脂滴逐漸增多，第21日時則胞漿內(nèi)可見大量呈顆粒狀的紅色脂滴;成脂+PTHrP組14日時才出現(xiàn)脂滴，但脂滴數(shù)量明顯低于同期成脂誘導(dǎo)組;而對照組各染色點(diǎn)均未出現(xiàn)紅色脂滴，見圖1。

2.3 實驗各組成脂LPL mRNA的表達(dá)水平 LPL mRNA表達(dá)水平各實驗組比較，成脂誘導(dǎo)組和成脂+PTHrP組均顯著高于對照組(P＜0.05)，成脂+PTHrP組顯著低于成脂誘導(dǎo)組，(P＜0.05)，見表3。

表2 實驗各組細(xì)胞增殖水平(±s，n=5)

表2 實驗各組細(xì)胞增殖水平(±s，n=5)

與對照組比較，*P＜0.01;與成脂誘導(dǎo)組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 第2日 第4日 第6日 第8日對照組 0.284 ±0.011 0.355 ±0.020 0.393 ±0.022 0.504 ±0.052成脂誘導(dǎo)組 0.395 ±0.021* 0.497 ±0.012* 0.616 ±0.035* 0.753 ±0.031*成脂 +PTHrP 組 0.373±0.016* 0.431 ±0.022＊△ 0.527±0.023＊△ 0.635±0.023＊△△

圖1 hMSCs成脂誘導(dǎo)實驗各組蘇丹紅IV染色

表3 實驗各組成脂LPL m RNA的表達(dá)水平(x±s，n=3)

3 討論

人類PTHrP基因組DNA定位于第12號染色體基因短臂［3］，主要包括9個外顯子和3個啟動子。PTHrP基因的前mRNA通過選擇性剪接，產(chǎn)生三種原始翻譯產(chǎn)物PTHrP(1－139)、PTHrP(1－141)和 PTHrP(1－173)，然后通過轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽修飾等多種水平的基因調(diào)控，形成具有不同的N末端、中間區(qū)域和C末端的成熟肽以及這些形式的結(jié)合物。只有成熟肽及其結(jié)合物才具有其獨(dú)特的生物學(xué)功能。PTHrP(1－34)、PTHrP(38－94)和PTHrP(107－139)是這個肽家族的主要分泌形式。近年來一些研究表明，PTHrP在胎兒和成人骨中也具有很強(qiáng)的協(xié)同骨形成的作用［4，5］。與PTH不同的是，PTHrP只是純粹的合成代謝劑，只選擇性地刺激骨形成。因此PTHrP在治療骨質(zhì)疏松中具有廣泛的應(yīng)用前景，對其研究也日趨增多，但在骨合成代謝中的分子生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚［6，7］。

本實驗分析比較了PTHrP(1－86)片段在hMSCs脂肪分化過程中的影響。有研究證實，MSCs在體外可通過不同的誘導(dǎo)劑分別向成骨和成脂方向分化［8］。本研究中，分別采用不同的誘導(dǎo)液培養(yǎng)hMSCs。表2結(jié)果顯示，成脂誘導(dǎo)組和成脂+PTHrP組的細(xì)胞增殖均顯著高于對照組，成脂+PTHrP組第2日時無顯著性增殖，從第4日起增殖顯著低于成脂誘導(dǎo)組。說明PTHrP(1－86)在后期有抑制成脂化細(xì)胞的增殖作用。圖1和表3結(jié)果顯示，成脂+PTHrP組出現(xiàn)脂滴陽性細(xì)胞的時間最晚，脂滴量相對于成脂誘導(dǎo)組較少;脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因LPLmRNA的表達(dá)水平也顯著低于成脂誘導(dǎo)組，由此可見PTHrP(1－86)在MSCs的成脂肪分化的過程中起到了抑制作用。有研究證明，MSCs具有內(nèi)在的成骨和成脂肪分化潛能，兩者之間的分化相互關(guān)聯(lián)［9］。通過本實驗分析，PTHrP可能是通過抑制MSCs的成脂肪分化，而刺激骨形成，為其治療骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 郭剛，劉新宇，梁東春，等.重組人甲狀旁腺素相關(guān)蛋白PTHrP1－86對骨質(zhì)疏松大鼠治療作用的實驗研究.中國骨質(zhì)疏松雜志，2008，14(1):13

2 黃定強(qiáng)，楊大鑒，黎萬榮，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)條件下向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的關(guān)系.中國臨床康復(fù)，2006，10(1):31

3 李瑛.甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白的新認(rèn)識.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，2003，12(4):362

4 Miao D，Li J，Xue Y，etal.Parathyroid hormone－related peptide is required for increased trabecular bone volume in parathyroid hormone－null mice.Endocrinology，2004，145(8):3554

5 Miao D，He B，Jiang Y，et al.Osteoblast－derived PTHrP is a potent endogenous bone anabolic agent that modifies the therapeutic efficacy of administered PTH 1 －34.JClin Invest，2005，115(9):2402

6 Antonio Casado － Díaz，Raquel Santiago － Mora，JoseéManuel Quesada.The N－ and C－terminal domains of parathyroid hormone－related protein affect differently the osteogenic and adipogenic potential of human mesenchymal stem cells.Experimental and Molecular Medicine，2010，42(2):87

7 徐進(jìn)，榮海欽.甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白促進(jìn)骨形成.國外醫(yī)學(xué)·骨科學(xué)分冊，2005，26(4):242

8 岑洪，林茂芳，黃河，等.雌激素受體α和β在間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨、成脂肪分化中的表達(dá)變化.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，22(6):883

9 黃定強(qiáng)，楊大鑒，黎萬榮，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)條件下向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的關(guān)系.中國臨床康復(fù)，2006，10(1):31