大腸癌中17號(hào)染色體異倍體與p53表達(dá)改變的相關(guān)性研究

張 旭 曹譯心 張翠薇 伍 洋

1（瀘州醫(yī)學(xué)院 病理教研室，瀘州646000）

2（瀘州醫(yī)學(xué)院 組胚教研室，瀘州646000）

3（瀘州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 急診科，瀘州646000）

大腸癌的發(fā)生發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，包括外界環(huán)境，自身因素，抑癌基因或癌基因的缺失、突變、激活及染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常改變等。p53 是重要的抑癌基因，p53 基因突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者的預(yù)后有關(guān)，p53 定位于染色體17p13.1，因此17號(hào)染色體的改變也受到越來越多的重視。本研究采用熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)檢測(cè)17號(hào)染色體的改變，并對(duì)其17號(hào)染色體位點(diǎn)存在的P53蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，希望能夠找出二者之間的相關(guān)性，并為大腸癌的預(yù)后提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012年大腸癌標(biāo)本67例，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理診斷為大腸癌，均為腺癌。其中男性37例，女性30例，中位年齡55歲，其它病理參數(shù)見表1。所有病例均為石蠟包埋，4 μm 厚切片。

1.2 FISH 檢測(cè)

17號(hào)（Spectrum red）染色體著絲粒探針，購(gòu)自美國(guó)Vysis公司。4μm 厚石蠟切片一張用于17號(hào)染色體FISH 分析。實(shí)驗(yàn)步驟如下：常規(guī)脫蠟水化，置于梯度酒精脫水，50℃水浴下30%酸性亞硫酸鈉預(yù)處理30分鐘，2×SSC（氯化鈉、檸檬酸鈉緩沖液）洗滌2 次，37 ℃蛋白酶K 消化10 分鐘，依次經(jīng)70%、85%、100%酒精各脫水2分鐘，自然干燥。取10μl探針混合液滴于玻片，加蓋玻片，橡膠水泥封片，放入原位雜交儀，37 ℃過夜，雜交后2×SSC 洗滌，暗處自然干燥，滴加二咪基苯基吲哚（DAPI）顯色液，蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用EnVision法，p53單克隆抗體及EnVision試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

FISH 檢測(cè)結(jié)果判定：低倍選定腫瘤區(qū)域，高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，不計(jì)數(shù)重疊細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色信號(hào)即為17號(hào)染色體倍體情況，細(xì)胞核內(nèi)紅色信號(hào)≥3個(gè)視為多倍體，＜2個(gè)信號(hào)視為單倍體。

免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)：p53以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)＞10%為陽性，＜10%為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 17號(hào)染色體異倍體和P53蛋白在腸癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

癌組織中17號(hào)染色體異倍體31例，其中多倍體29例，單倍體2例（見圖1A，B），以多倍體為主。17號(hào)染色體異倍體與患者年齡、性別，腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05），只與Dukes分期有關(guān)（P＜0.05），17號(hào)染色體異倍體在高中低分化癌中的發(fā)生率分別為62.5%（10／16），42.9%（12／28），39.1%（9／23）（見表1）。

p53在67例癌組織中的陽性表達(dá)率為55.2%（37／67，見圖2A，B），與臨床病理參數(shù)比較，其陽性表達(dá)與Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），而與其他臨床各參數(shù)之間比較顯著性差別（P＞0.05），p53在高中低分化癌中的陽性率分別為56.3%（9／16），60.7%（17／28），47.8%（11／23）（見表1）。

表1 17號(hào)染色體異倍體與P53蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 Chromosome 17aneuploidy and P53protein expression with clinicopathological parameters

2.2 大腸癌中17號(hào)染色體異倍體與p53蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性

17號(hào)染色體發(fā)現(xiàn)有31例異倍體，其中有14例與p53蛋白陽性表達(dá)例數(shù)相同，經(jīng)相關(guān)性分析顯示，二者之間無顯著相關(guān)性（P＝0.124）（見表2）。

表2 17號(hào)染色體多倍體與P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table 2 Correlation of chromosomes 17and P53protein expression

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展歸根到底是遺傳學(xué)的變化，其中主要是遺傳物質(zhì)的改變，包括染色體數(shù)目結(jié)構(gòu)的異常，染色體的數(shù)目異常表現(xiàn)多樣，常見有單倍體，三倍體，四倍體及以上等異倍體現(xiàn)象。檢測(cè)這些染色體的異常多數(shù)集中于惡性腫瘤，在大腸癌中，同樣存在染色體數(shù)目的異常情況，本研究采用FISH 技術(shù)檢測(cè)17號(hào)染色體著絲粒在大腸癌中的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17號(hào)染色體在67例大腸癌中有31例發(fā)生異倍體，其中多倍體29例，單倍體2例，因此可知大腸癌中17 號(hào)染色體異常多數(shù)是多倍體狀態(tài)。有學(xué)者［1］對(duì)胃癌中的17號(hào)染色體的改變進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌中同樣存在17號(hào)染色體多倍體增多的現(xiàn)象，99例中有56例為多倍體，2例為單倍體，與本研究結(jié)果基本相似。

早期已有報(bào)道［2］，17號(hào)染色體斷臂丟失是晚期大腸癌的標(biāo)記，是患者預(yù)后不良的指標(biāo)。本研究檢測(cè)17號(hào)染色體著絲粒的改變，17號(hào)染色體改變與臨床病理參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，與患者的年齡、性別及腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移均無關(guān)，而與Dukes分期有關(guān)，我們?cè)诒容^過程中，反復(fù)比對(duì)，結(jié)果仍然一致，我們分析認(rèn)為，在大腸癌中，17號(hào)染色體異倍體貫穿于癌的發(fā)生發(fā)展全過程中，可能與患者的預(yù)后無關(guān)。本結(jié)論與早期研究結(jié)果不一致，是否與研究例數(shù)有關(guān)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。在膀胱癌中研究發(fā)現(xiàn)，隨著分級(jí)的升高，17號(hào)染色體多倍體改變顯著增加，17 號(hào)染色體畸變與膀胱癌的分級(jí)呈正相關(guān)［3，4］。但本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示大腸癌中17號(hào)染色體改變與腫瘤分化程度無關(guān)，因此我們認(rèn)為在大腸癌中17號(hào)染色體的改變只與大腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)而與患者的預(yù)后無關(guān)。雖然未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是可以看出，17號(hào)染色體異倍體在高中低分化癌中的發(fā)生率依次降低，17號(hào)染色體在分化高的腫瘤中發(fā)生異倍體的頻率較高，這可能提示17號(hào)染色體異倍體與腫瘤的早期發(fā)生有關(guān)。

眾所周知，p53是重要的抑癌基因，在多種腫瘤中均表達(dá)增高，p53發(fā)生基因突變后，失去了控制細(xì)胞生長(zhǎng)及DNA 修復(fù)的作用，使染色體異常改變隨著傳代不斷遺傳，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡變，形成腫瘤［5］。本研究發(fā)現(xiàn)p53在大腸癌中的陽性表達(dá)率為55.2%，稍高于單寶珍等［6］研究結(jié)果（48.5%），而低于趙光明等［7］研究結(jié)果（66.7%）。我們還發(fā)現(xiàn)，p53表達(dá)與患者年齡、性別及分化程度無關(guān)，但有文獻(xiàn)報(bào)道［8，9］，30例大腸癌中，p53表達(dá)與分化程度有關(guān)，這可能與研究例數(shù)有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)顯示p53表達(dá)只與Dukes分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，隨著Dukes分期的增加，p53陽性表達(dá)例數(shù)增加，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例陽性例數(shù)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例，表明p53陽性表達(dá)可能與患者的預(yù)后相關(guān)，是患者預(yù)后差的標(biāo)記，這與眭怡群等［5］研究結(jié)果一致，因此我們提示未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的35例中8例陽性的患者應(yīng)該引起注意，加強(qiáng)隨訪。

p53是位于17號(hào)染色體短臂上的基因，突變型p53的表達(dá)是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因［10］，因此17號(hào)染色體的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，王權(quán)等［11］人應(yīng)用微衛(wèi)星雜合性缺失的方法發(fā)現(xiàn)胃癌中17號(hào)染色體可能存在3個(gè)與胃癌相關(guān)的基因，而p53可能是其中之一，但該研究還需要其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本研究采用FISH 方法檢測(cè)17號(hào)染色體著絲粒的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其異倍體的發(fā)生率與p53陽性表達(dá)率無關(guān)，該結(jié)果雖然與在乳腺癌中的研究結(jié)果［12］相似，但是我們分析認(rèn)為由于p53 是位于17號(hào)染色體上的基因，那么二者之間一定有某種聯(lián)系，這可能與研究方法和例數(shù)有關(guān)，也可能是17號(hào)染色體還存在其他的與p53相似的基因但尚未發(fā)現(xiàn)。

［1］魯海珍，吳玉鵬，羅巍，等.胃癌17 號(hào)染色體異倍體改變及TP53和拓?fù)洚悩?gòu)酶IIα 蛋白過表達(dá)與病理診斷的相關(guān)性［J］.中華腫瘤雜志，2009，31（10）：754－758.

［2］季晨陽，季丹，Smith DR，等.大腸腺癌17號(hào)染色體短臂等位基因丟失的病理意義［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，18（1）：22－24.

［3］李莉，丁奕星，徐苓，等.染色體3、7、17號(hào)和9p21位點(diǎn)在膀胱尿路上皮癌中的畸變情況及其臨床意義［J］.診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2012，11（1）：47－51.

［4］袁曉亮，甘衛(wèi)東，姚林方，等.熒光原位雜交技術(shù)在膀胱尿路上皮癌診斷中的臨床應(yīng)用［J］.中華腔鏡泌尿外科雜志（電子版），2012，6（1）：49－52.

［5］眭怡群，馮一中.自噬相關(guān)基因LC3、Beclin－1與凋亡相關(guān)基因p53、BCL－2在大腸癌中的表達(dá)及意義［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28（3）：282－286.

［6］單寶珍，童強(qiáng)，李梅，等.大腸癌發(fā)生中突變型P53與hMLHl表達(dá)的關(guān)系［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（3）：270－273.

［7］趙光明，高泉根，展瑞，等.Hpa、p53和nm23蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)意義［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2010，23（2）：118－120.

［8］肖薇.p53在大腸癌中表達(dá)的研究［J］.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（24）：82.

［9］劉偉杰，秦環(huán)龍，張惠箴，等.大腸癌中CerbB－2、P53、PCNA蛋白的表達(dá)及臨床意義［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（16）：2928－2930.

［10］Fridman JS，Lowe SW.Control of apoptosis by p53［J］.Oncogene，2003，22（56）：9030－9040.

［11］王權(quán)，溫玉剛，唐華美，等.胃癌17號(hào)染色體抑癌基因候選區(qū)域精細(xì)定位分析［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28（12）：2148－2451.

［12］Di Leo A，Gancberg D，Larsimont D，et al.HER－2amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in node－positive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline－based therapy or with cyclophosphamide，methotrexate，and 5－fluorouracil［J］.Clin Cancer Res，2002，8（5）：1107－1116.