PPARα/γ雙重激動劑的設(shè)計(jì)及分子動力學(xué)研究

王業(yè)柳，馬 英，王潤玲，王樹青，徐為人

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070；2.天津藥物研究院，天津市新藥設(shè)計(jì)與發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193）

糖尿病被列為繼心血管疾病及腫瘤之后的第三大疾病，目前全世界糖尿病患者中大部分是2型糖尿病，因此研究新型抗2型糖尿病藥迫在眉睫[1]。研究人員發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖因子活化受體PPARs是一類配體調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，有3種亞型：PPARα,PPAR γ,and PPARβ/δ。它們在治療肥胖、血脂異常、高血壓及胰島素抵抗等方面起著至關(guān)重要的作用，因此成為備受關(guān)注的降糖靶點(diǎn)[2]。激動PPARα或PPARγ雖能提高胰島素的敏感性，但單獨(dú)使用還是會產(chǎn)生如體質(zhì)量增加、液體積聚和肺水腫等副作用。雙重受體激動劑不僅能促進(jìn)代謝，還能減少單一受體激動劑所產(chǎn)生的副作用[3]，所以已經(jīng)成為受人矚目的新型抗2型糖尿病藥。本研究旨在從drug-like數(shù)據(jù)庫中篩選出潛在的PPARα/γ雙重激動劑，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾從而設(shè)計(jì)出新的PPARα/γ雙重激動劑。

1 材料與方法

1.1 受體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)處理由Schrodinger Suite 2009[Schrodinger（2009）.Schr dinger,LLC,New York]軟件中的Protein preparationwizard模塊完成。將下載的PPAR-α和γ靶點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID:1k71和1k74）[4]導(dǎo)入SchrodingerSuite2009，首先對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修正，參數(shù)設(shè)定為Assign bond orders（修正化學(xué)鍵），Add hydrogens（加氫），Treatmetals（處理金屬離子），Cap terminiby adding ACE&NMA residues（修正N端和C端的殘基結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤），經(jīng)處理后除去蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中的水分子和雜原子，只保留蛋白分子與原始配體。再對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，氫鍵優(yōu)化參數(shù)為Samplewaterorientations，優(yōu)化力場選擇OPLS 2005[5]，以RMSD 0.5魡為收斂標(biāo)準(zhǔn)。以原始配體小分子GW409544為中心，大小為10魡×10魡×10魡生成對接盒子文件。盒子文件的選取對結(jié)果的正確性有很大的影響，所以本實(shí)驗(yàn)以晶體庫中的PPAR γ（1k74）為例來驗(yàn)證對接方法和盒子文件的選擇是否合理。把晶體結(jié)構(gòu)中原始配體提取出來，對接到PPARγ（1k74）的配體結(jié)合區(qū)，再重新與晶體結(jié)構(gòu)中的配體疊合比對。對接后的結(jié)構(gòu)與配體原始結(jié)構(gòu)的均方根偏差（RMSD）值為0.16魡。說明盒子文件能夠適用模擬體系。以下的實(shí)驗(yàn)均采用這個(gè)盒子文件。

1.2 虛擬篩選 選取drug-like數(shù)據(jù)庫100 000個(gè)小分子作為虛擬篩選對象。配體優(yōu)化是在LigPre模塊中完成的。小分子優(yōu)化的力場為OPLS 2005，產(chǎn)生pH值7.0±2.0下的離子化狀態(tài)，去鹽，產(chǎn)生各種可能的互變異構(gòu)體。將優(yōu)化后的配體分別對入PPAR α/γ 的受體結(jié)合區(qū)，應(yīng)用 Glide[6]模塊“HTVS”（高通量虛擬篩選）評估蛋白質(zhì)和配體的結(jié)合能力。接著將得分排在前的1 000個(gè)化合物分別對入PPARα/γ的受體結(jié)合區(qū)，應(yīng)用“SP”（標(biāo)準(zhǔn)精度）采用柔性對接，柔性對接時(shí)要求考慮各種環(huán)的柔性情況，要求對接函數(shù)在打分時(shí)對非平面型的酰胺鍵構(gòu)象進(jìn)行罰分，其它參數(shù)為默認(rèn)值。

1.3 結(jié)構(gòu)修飾 “Core Hopping”[CombiGlide2.5（2009）Schrodinger LLC]模塊具有替換片段和分子對接兩大功能，所以成為從頭藥物設(shè)計(jì)的新技術(shù)。在“Core Hopping”過程中，第一步是定義模板化合物。首先定義需要替換的片段，這一任務(wù)由Define Combinationsstep完成。第二步需要定義受體盒子，這部分已在Receptor Grid Generation中介紹。第三部分準(zhǔn)備分子片段，分子片段來自于drug-like數(shù)據(jù)庫和ZINC數(shù)據(jù)庫中的片段數(shù)據(jù)庫。第四步把小分子片段連接到母核上，得到的結(jié)構(gòu)對接到受體里。最后，依據(jù)對接得分進(jìn)行篩選，得分的絕對值越大，配體與受體的親和力越強(qiáng)，結(jié)合力越好。

1.4 分子動力學(xué)模擬 利用Gromacs4.0軟件包將復(fù)合物放入正方體盒子中，加入簡單點(diǎn)電荷水分子（SPC），并加入抗衡離子，使模擬體系達(dá)到電中性，離子在模型中自動排布。模擬采用NVT系綜，使用v-rescale方法使系統(tǒng)溫度保持在300 K，范德華相互作用截?cái)喟霃綖?.4 nm，靜電相互作用采用PME算法。應(yīng)用最陡下降法對所有體系進(jìn)行1 000步能量優(yōu)化。優(yōu)化后，平衡體系：（1）限制重原子，等溫等容平衡水。（2）等溫等容平衡蛋白。（3）不限制任何原子，等溫等壓調(diào)整水盒子大小。（4）等溫等壓下進(jìn)行10 ns非限制性分子動力學(xué)模擬。

1.5 ADME預(yù)測 Schrodinger Suite 2009軟件中的QikProp[QikProp3.2（2009）Schrodinger LLC]模塊可以預(yù)測化合物的吸收、分布、代謝、排泄性質(zhì)。在QikProp模塊中，分子自動成中性狀態(tài)。在正常模式下，此模塊可以分析油水分配系數(shù)，水溶性，毒性。本實(shí)驗(yàn)對 logPo/w、PSA、logS、PMDCK 進(jìn)行預(yù)測。logPo/w指油水分布系數(shù)，改變藥物的油水分布系數(shù)達(dá)到提高其生物利用度的目的；logS指水溶性，改變藥物的水溶性提高藥物在血液中轉(zhuǎn)運(yùn)速度；PSA指極化表面積，與膜滲透相關(guān)的另一個(gè)參數(shù)；PMDCK指狗腎細(xì)胞培養(yǎng)，與腸通透性有關(guān)的參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PPARα/γ雙重激動劑模型 本實(shí)驗(yàn)以ragalitazar一種新型的PPARα/γ雙重激動劑為陽性對照藥[7]。對接結(jié)果列于表1。從對接結(jié)果可以看出所設(shè)計(jì)的9個(gè)化合物結(jié)合能均強(qiáng)于ragalitazar。

表1 對接結(jié)果Tab 1 The resultsofdocking by Glide

圖1為comp#4 A-B2-C1和ragalitazar與PPAR α（1k71）和 PPAR γ(1k74)結(jié)合模式圖。由圖中可以看出comp#4A-B2-C1和ragalitazar的酸性頭部分與PPARα（或PPARγ）中的4個(gè)重要氨基酸殘基 Ser280/Ser289，Tyr314/His323，Tyr464/Tyr473和His440/His449形成氫鍵。這些氨基酸殘基與配體形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)可以使AF-2螺旋穩(wěn)定于一種構(gòu)象，從而使PPAR處于激活構(gòu)象，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控。新設(shè)計(jì)的化合物因有大的疏水部分C而與疏水臂II形成更強(qiáng)的疏水作用。這使化合物的結(jié)合力與ragalitazar相比增強(qiáng)。comp#4與PPARα（1k71）和PPARγ（1k74）的對接得分分別是-14.09和-13.15，比ragalitazar-11.49和-12.29高出兩個(gè)以上數(shù)量級。

2.2 虛擬篩選和結(jié)構(gòu)修飾 通過對ZINC[8]數(shù)據(jù)庫中的drug-like數(shù)據(jù)庫進(jìn)行虛擬篩選，得出ZINC06088083小分子與受體PPARα和PPARγ結(jié)合最好。ZINC06088083中的酸性頭能與AF2螺旋區(qū)的 Tyr464（1k71）和 Tyr473（1k74）形成氫鍵，使其穩(wěn)定于激活構(gòu)象。而ZINC06088083的缺點(diǎn)是與受體的疏水臂匹配性差，所以需要進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾。具體修飾過程如圖2所示：首先，在1H-pyrazole環(huán)上添加疏水分子片段以提高與受體的疏水臂的匹配性，找出3個(gè)優(yōu)選片段C1、C2、C3；然后，對1H-pyrazole環(huán)進(jìn)行替換旨在找到結(jié)合更強(qiáng)的片段，找出3個(gè)優(yōu)選片段B1、B2、B3。這樣就產(chǎn)生了1×3×3=9個(gè)化合物。

2.3 分子動力學(xué)模擬結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)綜合結(jié)合模式和對接得分選出comp#4 A-B2-C1作為代表做動力學(xué)模擬。對PPAR空載、PPAR-ragalitazar和PPAR-comp#4的蛋白質(zhì)骨架進(jìn)行RMSD測算。如圖3所示PPARα/γ與comp#4很快達(dá)到了平衡狀態(tài)。分別穩(wěn)定于0.18 ns，0.22 ns。為了更好地觀察受體結(jié)構(gòu)的波動，對受體側(cè)鏈進(jìn)行RMSF測算，結(jié)果如圖3所示。PPARα/γ與comp#4的AF-2螺旋區(qū)RMSF的波動和PPARα/γ與ragalitazar的波動有相似的波動趨勢，顯示出新化合物comp#4與ragalitazar有相似的結(jié)合AF-2螺旋的功能。

2.4 ADME預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用Schrodinger2009軟件包中的QikProp模塊對與藥效相關(guān)的5個(gè)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果如表2所示。新設(shè)計(jì)的化合物的logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范圍內(nèi)。

表2 ADME預(yù)測Tab 2 Physiochem icaldescriptorscalculated by QP

3 討論

3.1 PPARα/γ雙重激動劑的設(shè)計(jì) PPARs的天然配體是脂肪酸類化合物，因此，激動劑與PPARs的結(jié)合位點(diǎn)幾乎是疏水的。Y型受體結(jié)合區(qū)域的3個(gè)疏水臂產(chǎn)生的疏水作用是設(shè)計(jì)PPARs新激動劑的關(guān)鍵。PPAR受體結(jié)合區(qū)域由極性區(qū)、疏水區(qū)和親水區(qū)組成。AF-2螺旋在極性區(qū)內(nèi)。PPAR激動劑的酸性頭與AF-2螺旋形成氫鍵，它的疏水尾與PPAR的疏水區(qū)和親水區(qū)結(jié)合。這種結(jié)合方式穩(wěn)定了AF-2螺旋區(qū)域構(gòu)象。通過與配體的結(jié)合降低了AF-2的電子遷移率促進(jìn)了電子夾的形成，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控[9]。靶點(diǎn)的選擇對化合物的設(shè)計(jì)起到至關(guān)重要的作用。從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫下載中選擇了PPARα和PPARγ兩個(gè)代表性的受體結(jié)構(gòu)（PDB ID 1k71和 1k74），選擇這兩個(gè)蛋白的原因如下：（1）這兩個(gè)蛋白包含了相同的配體GW409544，它們與GW409544的結(jié)合力相似，但GW409544對PPARα受體的活性較弱。（2）這兩個(gè)蛋白是人源[10]。ragalitazar是一種高效高選擇性的PPARα/γ雙重激動劑,它引發(fā)的PPARα生物活性是PPARα激動劑（WY-14643）的0.97倍，引發(fā)PPARγ生物活性是PPARγ激動劑（羅格列酮）的1.17倍[11]。ragalitazar的酸性頭部分與PPARα（或PPARγ）中的4個(gè)重要氨基酸殘基Ser280/Ser289,Tyr314/His323,Tyr464/Tyr473和His440/His449形成氫鍵，起到激動受體的作用。由圖1可以看出comp#4與這4個(gè)重要氨基酸殘基也形成了氫鍵，而本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的化合物不僅能和這些關(guān)鍵殘基形成氫鍵，還能與受體的疏水區(qū)形成疏水作用。這是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的化合物創(chuàng)新點(diǎn)所在。

3.2 PPARα/γ雙重激動劑的分子動力學(xué)研究 分子動力模擬是應(yīng)用生化分子體系力場及根據(jù)牛頓運(yùn)動力學(xué)原理所發(fā)展的計(jì)算方法。系統(tǒng)中的粒子的運(yùn)動有正確的物理依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)比較了PPARα/γ與comp#4的AF-2螺旋區(qū)RMSF的波動和PPARα/γ與ragalitazar的波動，發(fā)現(xiàn)兩者的波動趨勢相近。進(jìn)一步在理論上證明設(shè)計(jì)的化合物與已知的激動劑ragalitazar具有相似的功能。

3.3 ADME預(yù)測 現(xiàn)今，一個(gè)成功用作口服藥物的化合物必須具有足夠的水溶性以及和其臨床藥效相關(guān)的通透性。準(zhǔn)確的ADME預(yù)測對進(jìn)一步合成起到指導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的化合物logPo/w、PSA、logS、PMDCK均在合理的范圍內(nèi)。盡管logPo/w越高，結(jié)合能力越強(qiáng)，但不能過度的增強(qiáng)logPo/w水平，這樣會導(dǎo)致藥物在體內(nèi)分布較差[12]。從表1可以得出所設(shè)計(jì)的化合物可以作為新藥的目標(biāo)化合物，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。

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