高效液相色譜法測定固腸膠囊中沒食子酸的含量

天津市大港藥檢所（300270）林月英

固腸膠囊是由五倍子、訶子、烏梅、厚樸等十幾味藥組成的中藥成方制劑。而原國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-695（Z-138）-2005（Z）只對厚樸進(jìn)行了含量控制，但固腸膠囊中的五倍子，訶子的指標(biāo)成分是沒食子酸，具有明顯的澀腸止瀉功效。為能更好控制該藥的質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法測定固腸膠囊中沒食子酸的含量。

1 儀器與試藥

Agilent-1200高效液相色譜儀。沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200302），水為去離子水，甲醇為色譜純，磷酸、鹽酸為分析純。固腸膠囊（天津某藥廠提供，批號為5070003、570005、570006）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX TC-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（8∶92）；檢測波長：271nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml含沒食子酸40μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品0.25g，精密稱定，精密加入3mol/L鹽酸50ml，稱定重量，置水浴上加熱回流4h，放冷，稱定重量，加3mol/L鹽酸補足減失的重量，離心5min（3000r/min），精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方取除五倍子及訶子的各味藥材，按【制法】制得樣品，再按“2.2.2”項下方法制備，制得陰性樣品溶液。

2.2.4 陰性干擾試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果表明，沒食子酸色譜峰與其他峰得到很好分離，陰性樣品溶液無干擾（見附圖）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇分別制成濃度為每1ml中含沒食子酸0.7944、1.9869、9.93、19.86、39.72、99.3、198.6μg的對照品溶液，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件分析，分別測定各峰面積，以對照品進(jìn)樣的量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=-4.1775＋3174.2×X，r=0.9999。結(jié)果表明，沒食子酸在0.007944～1.986μg范圍內(nèi)線性良好。

2.4 精密度試驗 取同一批號（5070003）適量，取0.25g，精密稱定，按照“2.2.2”項供試品溶液制備操作，按“2.1”項色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，樣品中沒食子酸峰面積平均值為1378，RSD為0.06%。

2.5 重現(xiàn)性試驗 取同一批號（5070003）適量，取0.25g，共6份，精密稱定，按照“2.2.2”項供試品溶液制備操作，按“2.1”項色譜條件分析測定，樣品中沒食子酸含量平均值為43.58mg/g，RSD為0.34%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批號（5070003）適量，取0.25g，精密稱定，按照“2.2.2”項供試品溶液制備操作，按“2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、24h進(jìn)樣，測定，樣品中沒食子酸峰面積平均值為1367，RSD為0.83%，結(jié)果表明，供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

附表1 回收率試驗結(jié)果

附表2 三批樣品含量測定結(jié)果

附表3 不同色譜柱對含量測定的影響（mg/粒）

附表4 鹽酸濃度的比較

附表5 提取時間的比較

2.7 回收率試驗及樣品測定 取同一批號（5070003）樣品適量，取0.125g，共6份，精密稱定，分別精密加入每1ml中含沒食子0.1087mg的對照品溶液50ml，按照“2.2.2”項供試品溶液制備操作，按“2.1”項色譜條件分析。計算得沒食子酸平均回收率為99.51%，RSD為0.43%（見附表1）。計算樣品中沒食子酸含量（見附表2）。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動相的優(yōu)化 《中國藥典》[1]2010年版一部中，五倍子含量測定采用的流動相為甲醇-0.1%磷酸（15∶85），經(jīng)試驗，此流動相沒食子酸色譜峰出峰較快，分離效果欠佳，因此，將流動相比例調(diào)整為甲醇-0.1%磷酸（8∶92），結(jié)果供試品色譜中沒食子酸色譜峰為8min左右出峰，且與其他雜質(zhì)峰分離度均大于1.5。

3.1.2 色譜柱的選擇

3.1.2.1 不同色譜柱對分離效果的比較 不同廠家生產(chǎn)的色譜柱（Aglent、DIKMA、Phenomenex）采用甲醇-0.1%磷酸（8∶92）為流動相，樣品分離效果均較好。

3.1.2.2 不同色譜柱對含量測定的影響 取“2.7”項下3個批號的供試品溶液，分別采用Agilent ZORBAX TC C18，phenomenex C18及DIKMA Diamonsil C18，按照“2.1”項色譜條件分析測定，計算樣品中沒食子酸的含量（見附表3）。結(jié)果表明，不同的色譜柱的含量測定結(jié)果基本一致。

3.2 提取方法的確定與考察

3.2.1 提取溶劑的選擇 固腸膠囊處方中含有五倍子及訶子，其主要成分為鞣質(zhì)，因此，采用鹽酸水解后測定沒食子酸的方法測定樣品中鞣質(zhì)的含量。鹽酸濃度的選擇：取同一批號（5070003）樣品，取0.25g，精密稱定，共8份（2份做平行試驗），分別精密加入濃度為2、3、4、5mol/L的鹽酸50ml，稱定重量，置水浴上加熱回流3小時，放冷，稱定重量，分別用各自的溶劑補足減失的重量，離心5min（3000r/min），精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。以試驗結(jié)果為依據(jù)，采用濃度為3mol/L的鹽酸作為提取溶劑（見附表4）。

3.2.2 提取時間的考察 取同一批號（5070003）樣品，取0.25g，精密稱定，共10份（2份做平行試驗），分別精密加入3mol/L的鹽酸50ml，稱定重量，分別置水浴上加熱回流1、2、3、4、5h，放冷，稱定重量，用3mol/L的鹽酸補足減失的重量，離心5min（3000r/min），精密量取上清液5ml，置25ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。以試驗結(jié)果為依據(jù)，將提取時間定為4小時（見附表5）。3.2.3 水解后樣品稀釋溶劑的考察 取同一水解后的酸水溶液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，分別用50%甲醇及50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別進(jìn)樣測定。以試驗結(jié)果為依據(jù)選用50%甲醇作為稀釋溶劑。