基于CIEF的全柱成像檢測在生命分析中的應用

于建釗

(南京大學化學化工學院，南京210093)

毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing，CIEF)是指在毛細管中進行的等電聚焦[1].CIEF是根據物質的等電點(pI)不同而進行分離的.采用兩性電解質混合物作為載體電解質，當在用溶質和兩性電解質混合溶液充滿的毛細管兩端加電場時，帶電的兩性離子和蛋白質以不同的速度遷移通過介質，帶正電的向負極遷移，帶負電的向正極遷移，當它們遷移至pH=p I的區(qū)帶時，靜電荷為零，不再遷移，這個過程稱為等電聚焦.CIEF是分析兩性生物分子的強有力工具，具有分離時間短、分辨率高、進樣量少等優(yōu)點.但傳統(tǒng)的CIEF使用單點檢測器，即使所有樣品在到達檢測器前已經完成分離，也要等到所有聚焦區(qū)帶都通過檢測器后才能結束分離檢測.從形成pH梯度到樣品聚焦完成通常只需要5 min，而聚焦區(qū)帶依次通過檢測器卻需要10～40 min，不僅增加了額外的分析時間，并且移動過程會導致分離譜帶展寬而影響分離度和分辨率，還可能導致蛋白質沉淀.

全柱成像檢測(whole column imaging detection，WCID)是Pawliszyn等自1992年發(fā)展起來的一項檢測技術[2－7].信號可以是折射率變化、紫外吸收、激光誘導熒光.折射率變化檢測器是通用檢測器，但靈敏度較低，在最佳條件下對蛋白質的檢測限僅為10－6M.激光誘導熒光檢測器具有非常高的靈敏度，檢測限可達10－12M，但熒光標記可能會使蛋白質或肽的等電點改變.紫外吸收檢測器靈敏度介于前兩者之間，不需要對待測物進行熒光標記，適用于大部分蛋白質.目前，基于紫外吸收全柱成像檢測的商品化毛細管等電聚焦儀(iCE280 Analyzer)已被推出.該儀器廣泛用于蛋白質、多肽等生物分子的微觀不均一性表征和質量控制.

WCID克服了傳統(tǒng)CIEF的不足，采用一個動態(tài)檢測器如電荷耦合裝置(CCD)照相機或光二極管陣列(PDA)對整個分離毛細管柱(5 cm或更短)進行實時檢測.整個毛細管內不同時間與不同位置上發(fā)生的任何事件均能得到檢測.WCID不僅能對樣品進行常規(guī)的分離分析，還能在分離的同時提取出有關動態(tài)過程的動力學參數，從而獲取多重信息.因此，CIEF－WCID技術在生物樣品的分離分析、蛋白質組學的研究中有著廣泛的應用前景.

1 生物樣品的分離分析

1.1 等電點的測定

CIEF－WCID技術可以應用于蛋白質或其他他兩性物質等電點的測定.向待測樣品中加入等電點標記物(p Imarkers)作為內標，通過比較譜圖中待測物質峰與等電點標記物峰的相對位置，即可得到待測物質的等電點信息.本法測得的等電點，其標準偏差小于0.01個pH單位[8].

應用本方法，Wu等[9]實現了人體血紅蛋白變異體、細胞色素C、肌紅蛋白和轉鐵蛋白4種蛋白質樣品的分離與等電點測定的同時進行.Wu等[10]使花生過敏源及其抗體的等電點得到驗證，整個過程僅僅用時320 s，和凝膠等電聚焦相比大大縮短了分析時間.本方法不僅適用于蛋白質或肽，還被用來測定病毒這種由蛋白質包裹遺傳物質而形成的復合體的等電點.Goodridge等[11]測定了諾羅病毒(norovirus)的病毒樣顆粒的等電點，所得數據具有良好的重現性，且與理論計算的數值相符.

1.2 糖型的分離

應用CIEF－WCID，Dou[12]等建立了分離促紅細胞生成素(EPO)糖型的快速高分辨分析方法(圖1).該方法不僅可以直接應用于重組EPO的質量控制分析，而且對體育運動中EPO作為興奮劑的檢測具有重要意義.

1.3 蛋白質的快速二維表征

最近，CIEF－WCID還被用于蛋白質的快速二維表征:首先利用毛細管等電聚焦測定蛋白質的等電點，然后取消聚焦電壓，利用全柱成像檢測測定蛋白質的擴散系數，進而估算蛋白質的分子質量.Liu[13]等選取了16種不同的氨基酸和蛋白質(分子質量從295～272 000)進行測試.同經典的二維凝膠電泳相比，本方法具有快速，易于操作，結果更準確等優(yōu)勢.本方法可以實現低到中等復雜程度的蛋白質樣品的快速二維表征.

圖1 EPO的等電聚焦圖

2 研究蛋白質與其配體的相互作用

2.1 蛋白質之間的相互作用

蛋白質之間存在很強的相互作用時，蛋白質的等電點會發(fā)生改變，當相互作用足夠強時就會形成蛋白質的絡合物或者結合物.應用全柱成像技術我們能監(jiān)測到整個過程，進而研究蛋白質的相關性質.Wu[14]等把牛血清白蛋白(BSA)、鏈霉親和素(streptavidin)和生物素標記的牛血清白蛋白(biotin－labeled－BSA)作為模型蛋白，成功展示了該方法的可行性.將BSA與streptavidin混合后進行等電聚焦，經全柱成像檢測發(fā)現:與分別進樣相比，既沒有新峰出現，原來兩種蛋白質峰的位置也沒有任何改變.這表明兩種蛋白質等電聚焦過程是相互獨立的，它們之間沒有強的相互作用.然而將biotin－labeled－BSA和streptavidin混合進樣時，聚焦譜圖顯示有一新峰出現，這個新峰屬于二者的絡合物，由此說明二者之間有極強的親和力.此方法進一步應用于免疫反應的研究.例如，花生過敏原Ara hⅠ、Ara hⅡ與兔 γ－球蛋白的反應[10].固定過敏原溶液(Ag)含量，改變γ－球蛋白(rabbit IgG antibody，Ab)的含量，分別進行等電聚焦，比較全柱成像譜圖可知:隨著Ab含量的增加，Ara hⅡ的聚焦區(qū)帶比Ara hⅠ的聚焦區(qū)帶先消失(圖2)，這表明在免疫反應中Ara hⅡ與抗體的親和力更強.此外，Liu和Pawliszyn[15]利用非共價的熒光染料(NanoOrange)標記MS2病毒、抗體和二者形成的免疫復合體，并通過激光誘導熒光全柱成像觀察了它們在免疫反應中的改變，進而發(fā)現病毒與抗體的相對濃度對形成的免疫復合體的微觀不均一性有很大的影響.

圖2 花生過敏源(Ag)與兔γ－球蛋白(Ab)混合物的等電聚焦圖

2.2 蛋白質與DNA的相互作用

近來，利用全柱成像技術建立了一種研究蛋白質與DNA相互作用的新方法——動態(tài)動力學毛細管等電聚焦法(dynamic kinetic capillary isoelectric focusing).該方法將相互作用的蛋白質與DNA混合，將混合物等電聚焦，通過全柱成像觀察，蛋白質和蛋白質－DNA復合物將會聚焦成區(qū)帶，而非結合DNA(包含未結合部分和由于離解而釋放的部分)在電場的作用下將遷移出分離柱.隨著復合物的離解，其峰面積將逐漸減小(圖3).利用峰面積的自然對數對離解時間作圖，即可得到相關的離解速率常數.該方法成功測定了單鏈DNA結合蛋白(single－stranded DNA binding protein)和寡核苷酸(oligonucleotide，fDNA)的離解速率常數并表征了蛋白質和DNA間的特異和非特異相互作用[16].利用該方法，核酸酶P1不能完全酶解某些DNA樣品的原因得到確認，即:DNA與蛋白質非特異性結合形成復合物，因而降低了酶解效率[17].

圖3 不同離解時間條件下SSB－fDNA復合物CIEF譜圖

2.3 蛋白質與磷脂的相互作用

蛋白質與磷脂之間的相互作用在蛋白質同磷脂膜的結合過程中起著重要作用.當磷脂與蛋白質存在相互作用時，會改變蛋白質的結構進而改變其等電點.應用CIEF－WCID技術，Bo等對磷脂與蛋白質之間的相互作用做了一系列研究[18－20].此項研究首先考察了7種不同等電點的蛋白質與兩性卵磷脂之間的相互作用.7種蛋白質的化學、物理性質不同，與卵磷脂的相互作用也不同，這點在聚焦譜圖中得到了充分的展示.其次，鈣離子的存在會對磷脂與蛋白質相互作用產生影響.一方面，鈣離子能夠嵌入磷脂膜中，改變膜的性質.另一方面，鈣離子與不同蛋白質的結合作用，改變蛋白質的構象.二者共同影響磷脂與蛋白質之間的相互作用.之后，磷脂與蛋白質之間相互作用的動態(tài)過程得到監(jiān)測，其結果表明疏水作用、靜電作用和氫鍵作用是影響蛋白質與磷脂膜相互作用的主要因素，而蛋白質在與磷脂膜相互作用時有多個結合位點，不同結合位點的結合機理不同.

2.4 蛋白質與藥物的相互作用

CIEF－WCID還是一種簡單、方便的研究蛋白質與藥物相互作用的方法.其研究結果為進一步了解藥物的活性和毒性提供有用的信息進而改善它們的臨床效果.

將藥物與靶蛋白以不同物質的量比混合(1∶1、1∶10、1∶50、1∶100)，在37℃下反應.分別取不同反應時間(0、0.5、1、4、6、8、12、24、48 h)的混合物進行等電聚焦，與靶蛋白作對照.通過全柱成像觀察(圖4)，發(fā)現藥物的加入會使蛋白質的等電點有所改變，并且隨著作用時間的增加，這種改變越來越明顯，蛋白質的峰會逐漸展寬、減小直到消失.等電點的改變和藥物引起的蛋白質峰的消失表明了蛋白質與藥物之間存在很強的相互作用.而峰的展寬可能是由于靶蛋白與藥物有多個結合位點，因而生成了多種復合物.這些現象對研究多大藥物劑量才會影響蛋白質結構有著重要意義.此方法已應用在含鉑抗癌藥物與人血紅蛋白(human hemoglobin)、人血清白蛋白(human serum albumin)的相互作用的研究中[21－22].

圖4 人血紅蛋白與含鉑抗癌藥物(物質的量比1∶10)作用不同時間的譜圖

3 蛋白反應機理的研究

蛋白反應在生物學，生物化學和生物技術中有著重要作用.通常，蛋白質的變性，還原，?；确磻獣淖兊鞍踪|的結構、構象或帶電基團，從而引起蛋白質等電點的變化.因此，等電聚焦能夠很好的監(jiān)測這些反應，提供反應的動力學或是中間產物的壽命等信息.

Liu等[23]應用CIEF－WCID技術監(jiān)測了蛋白質變性、還原和氨基甲酰化的動力學過程.聚焦區(qū)帶清楚地顯示出反應不同時間生成的物質不同并且蛋白質不完全變性的中間產物與完全變性產物相比有著更高的等電點.當蛋白質同尿素溶液相互作用時，其氨基甲?；a物得到檢出，同原蛋白質相比其等電點有顯著降低(圖5).通過此種方法，這些反應的機理得到了合理的解釋.并得出結論:在高濃度的尿素條件下，蛋白質的變性過程可能是變性反應和還原反應共同作用的結果.采用CIEF－WCID對蛋白質的反應機理進行研究有著顯著優(yōu)點:首先，毛細管等電聚焦只對兩性物質有作用，這樣就避免了非兩性物質的干擾.其次，使用激光誘導熒光檢測器可以獲得高的靈敏度.最后，分析時間短.每次分析只需要10 min，而常規(guī)的光譜分析法卻需要幾個小時.

圖5 不同反應時間6M尿素溶液中綠色熒光蛋白的等電聚焦圖

4 結語

毛細管等電聚焦－全柱成像檢測是20世紀90年代初發(fā)展起來的一項檢測技術.該技術創(chuàng)新性的將常規(guī)分離方法中單點檢測方式改為多點檢測方式，由于樣品區(qū)帶不需要轉移，因此縮短了分析時間，提高了分辨率.同時由于對分離毛細管內的情況進行實時監(jiān)測，可以得到更多信息，如樣品的相互作用過程，擴散系數等.因而該技術在生物分子的分離分析、蛋白質與配體的相互作用及其機理的研究中有著越來越廣泛的應用.而隨著更靈敏CCD的出現，熒光標記和檢測技術的發(fā)展，以及在線富集技術的聯用和多功能集成化的微流控芯片的采用，毛細管等電聚焦－全柱成像檢測技術必將有著更進一步的發(fā)展.

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