延胡索總生物堿對急性心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡及凋亡相關基因表達的影響*

孫世曉 楊添淞 趙偉麗 趙楠 田明

（黑龍江中醫(yī)藥大學·哈爾濱 150040）

前言 中藥延胡索在臨床應用已有上千年歷史，早在《雷公炮炙論》即記載“心痛欲死，速覓延胡”，［1］。該藥目前在臨床上常用于治療心肌缺血、心絞痛、心律失常、早搏等，具有顯著療效。實驗資料表明，

延胡索能影響冠狀動脈血流量、心肌收縮力和心肌細胞內鈣離子濃度，并能減輕心肌壞死程度，改善壞死邊緣區(qū)心肌的營養(yǎng)供血［2、3、4、5］，但在目前，針對延胡索總生物堿抗心肌細胞凋亡的研究尚未見報道，故本實驗進行了相關研究，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料動物

70只健康成年Wistar大鼠，體重220±20g,雌雄各半，購于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK黑2008-004；儀器：PCR儀，Image-ProPlus5.0圖像分析系統，GIS凝膠成像分析系統，高速冷凍離心機，動物呼吸機。藥品：鹽酸普萘洛爾，批號；0901209，天津力生制藥股份有限公司生產；延胡索總生物堿由中藥實驗室自行提取，經光譜比色檢測并計算其純度達到60%，試劑：TUNEL試劑盒，rTaq酶，bax、bcl-2和caspase-3引物，B-Actin。以上試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 隨機分為7組：正常組、假手術組(只穿線不結扎)、模型組，延胡索總生物堿低劑量(0.5mg／kg)組、中劑量(1.Omg／kg)組、高劑量(2.Omg／kg)組、鹽酸普萘洛組；(0.5mg／kg)組，每組10只。各組連續(xù)灌服給藥14天，其中假手術組、模型組給予灌服等體積蒸餾水。

1.2.2 造模 末次灌胃1小時后，除對照組、假手術組外，其余各組通過冠狀動脈結扎復制急性心肌缺血大鼠模型。

1.2.3 心臟標本采集 在冠脈結扎3小時后處死大鼠，立即取出心臟用冰鹽水清洗并除掉周圍大血管、左右心房、右心室及結締組織，在心臟結扎線以下平行冠狀溝將心室橫斷切成5片，將第2片放入4%多聚甲醛固定液中4℃固定24小時，制作石蠟切片用于TUNEL檢測：第3片放入液氮中凍存，用于RTPCR檢測。

1.2.4 TUNEL檢測 取大鼠心肌組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度入水，蛋白酶K消化，0.01MPBS沖洗，0.3%H202,處理，50u1TUNEL反應混合液孵育，DAB顯色，蘇木素淡染，烤干后樹膠封片。用光鏡在200倍視野下隨機取10個視野，經Image-Pro Plus5.0圖像分析系統進行掃描，以染色強度計算凋亡陽性細胞百分率。

1.2.5 RT-PCR檢測 取大鼠心肌組織50～lOOmg置研缽中研磨，加Trizol試劑后轉移至rppendorf管中，12000rpm、4℃離心取上清液，加三氯甲烷混勻，12000rpm、4℃再次離心取水相，加異丙醇混勻，12000rpm、4℃離心后棄上清液，加無水乙醇漂洗沉淀，7500rpm、4℃離心后棄上清液，測定RNA純度，然后配制RNA標準液并進行逆轉錄反應。Bcl-2上 游 引 物 為：CCCTGGCATCTTCTCCTTC，下 游 引 物 為：CATCTCCCTGTTGACGCTC；Bax上 游引物為：GAAGCTGAGCGAGTGTCTCC，下游引物為：GATCAGCTCGGGCACTTTAG；Caspase-3上 游 引 物為：TCTGACTGGAAAGCCGAAACTC， 下 游 引 物 為：ACGGGATCTGTTTCTTTGCATG。以β-actin作為內參照。用含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，GIS凝膠成像分析系統拍照并對產物條進行分析。

1.2.6 統計方法 以上結果以均數±標準差表示，統計處理用SPSS11.5軟件進行。

2 結果

以上結果見表1和圖1、圖2、圖3。

表1：延胡索總生物堿對急性心肌缺血大鼠細胞凋亡的影響(±S，n=10)

表1：延胡索總生物堿對急性心肌缺血大鼠細胞凋亡的影響(±S，n=10)

注：與正常組比較：·P

caspase-3基因相對表達量正常組 0.3±0.02 0.45±0.09 0.27±0.03 0.07±0.03假手術組 0.2±0.03 0.43±0.06 0.25±0.02 0.06±0.03模型組 13.5±0.25* 0.15±0.03* 0.52±0.07* 0.19±0.02*高劑量組 5.8±0.07#◇ 046+0.030#◇ 0.16±0.05#◇ 0.08±0.05#◇中劑量組 5.1±0.12#◇ 0.43±0.08#◇ 0.18±0.03#◇ 0.08±0.06#◇低劑量組 9.1±0.35# 0.35±0.06# 0.23±0.04# 0.12±0.02#陽性藥組 5.7±0.11#◇ 0.44±0.04#◇ 0.16±0.05#◇ 0.07±0.03#◇組 別凋亡陽性細胞百分率(%)bcl基因相對表達量bax基因相對表達量

與正常組比較，模型組心肌細胞凋亡陽性率增多P<0.01；與模型組比較，延胡索總生物堿高、中、低劑量組和普萘洛爾組心肌細胞凋亡陽性率減少P

3 討論

研究表明［6、7］，在心臟生理、病理的發(fā)展過程中，能夠引起心肌細胞產生凋亡的原因多種多樣，有機械刺激、細胞因子、超負荷鈣離子、氧自由基、細菌毒素、缺氧等，因此，心肌細胞凋亡現象是普遍存在的。已有實驗證實，急性心肌缺血也能誘發(fā)心肌細胞產生凋亡，如Saraste在研究中發(fā)現［8］，大鼠冠狀動脈結扎后1h內，心肌細胞無丟失現象，結扎2h后，心肌細胞出現凋亡和壞死，細胞凋亡高峰發(fā)生在結扎5h后，細胞壞死高峰發(fā)生在結扎24h后，該結果提示大鼠冠狀動脈結扎后，早期心肌損傷以凋亡為主，后期以壞死為主，說明細胞凋亡和細胞壞死在急性心肌缺血中是相互獨立的。傳統觀念認為，急性心肌缺血所致的心機損傷主要是心肌壞死，但現在已經清楚，急性心肌缺血時還存在心肌細胞凋亡發(fā)生。心肌細胞屬于終末期分化細胞，幾乎無再生能力［9］，如果能設法抑制急性缺血后心肌細胞凋亡，增加存活心肌細胞數量，無疑會有利于防治心肌缺血和促進心功能的恢復，這對患者的長期預后非常有益。

目前認為，心肌細胞凋亡有兩種信號轉導途徑［10、11］：即細胞表面死亡受體途徑和線粒體死亡途徑。細胞表面死亡受體途徑與腫瘤壞死因子和Fas啟動有關，線粒體死亡途徑則是由Bcl-2家族成員激活而引起。Bcl-2家族成員分為兩個亞族，即抗凋亡蛋白亞族和前凋亡蛋白亞族，前者包括Bcl-2和Bcl-xL，后者包括Bax、Bak、Bid和Bad等。在正常情況下，Bc1-2家族的大部分抗凋亡蛋白一般作為細胞器膜(如線粒體、內質網和核膜)的整合膜蛋白被隔離起來，而前凋亡蛋白則以非活性的形式定位分布于胞液中或細胞質骨架上，當有凋亡刺激時，前凋亡蛋白成員發(fā)生加工修飾，易位于線粒體外膜上，引起線粒體通透性和膜電位改變，釋放細胞色素C、凋亡誘導因子等，啟動半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)級聯反應，激活Caspase-3使細胞產生凋亡。

本實驗觀察了延胡索總生物堿對急性心肌缺血模型大鼠心肌細胞凋亡的影響，同時觀察了各組bcl-2、bax和caspase-3基因表達的變化，實驗結果表明，模型組心肌細胞凋亡陽性率明顯增多，延胡索總生物堿高、中、低劑量組心肌細胞凋亡陽性率明顯減少，模型組bcl-2基因相對表達量減少，bax和caspase-3基因相對表達量增多，延胡索總生物堿高、中、低劑量紐bcl-2基因相對表達量增多，bax和caspase-3基因相對表達量降低。以上結果表明，延胡索總生物堿高、中、低劑量具有抗急性心肌缺血模型大鼠心肌細胞凋亡作用，該作用與調節(jié)bcl-2、bax和caspase-3基因表達有關。

［1］李時珍:本草綱目(上).人民衛(wèi)生出版社，2006，555.

［2］李榮,吳偉,李文晞,等.延胡索堿預處理對缺血再灌注心肌鈣泵及鈉鉀泵活性的影響.遼寧中醫(yī)雜志,2010，37(8):1616-1615.

［3］閔消,舒思潔,吳基良,等.延胡索乙素對大鼠實驗性心肌缺血的保護作用.中國基層醫(yī)藥,2001,8(5):430-431.

［4］邱蓉麗,李祥,陳建偉,等.延胡索總生物堿抗心肌缺血作用的實驗研究.中國中醫(yī)藥科技,2001,8(4):265.

［5］閔清,白育庭,舒思潔,等.延胡索乙素對異丙腎上腺素所致心肌壞死的保護作用,中醫(yī)藥學報,2001,29(4):44-45.

［6］0liVetti G,QUairri F,Sala R,etal ACute myocardial in farction in human is assOCiated with activatiOn Of prOgrammed myOCyte Cell death in the surviving purtion of the heart.Mof Cell cardio,1996，28:2005-2016.

［7］Fliss H,Gattinger D.ApoptOsis in isch em ic and reperfused ratmy ocard ium.Circ Res,1996,79:949-956.

［8］SarasteA,PullekiK,etal.Apoptosis in human acute myOcardial infarction，J Cireulation.1997,95 (2):320-323.

［9］QU Chao-fa,MA Li-kun,XU Shao-dong,WU Xue-ping.Cardiomyocyte apoposis and cxpression of Bcl-2,Bax protein after acutemyocardial infarction and late repertusion in dogs.Chinese Journal of Pathophysiolo gy,2007,23(4):656-659.

［10］Yuan J,Shaham S,Ledoux S.The C.elegans cell death gene ced-3 encodes a prOtein similartOmammalian interleukin-1 betaconverting enzyme.Cell,1993,75(4):641-652.

［11］Nicholson DW,ThomberryNA.Caspases:killerproteases.Trends Biochem Sci,1997,22(8):299-306.