外源性瘦素對硫代乙酰胺致急性肝損傷保護機制的研究

黃國榮 丁忠陽 張家明

南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇無錫 214023

肝損傷是由各種原因引起的肝臟功能的異常，嚴重或持續(xù)的肝損傷最終導致肝功能衰竭。臨床上造成的急性肝損傷原因主要有病毒感染、服藥不當、乙醇攝入過量、誤服有毒食物等。目前肝損傷的防治在國內外是個嚴峻的課題。通過建立急性肝損傷動物模型，研究其發(fā)生機制，篩選保肝藥物及其原理，具有重要的現(xiàn)實意義。最近研究表明，瘦素對胃，小腸、肺、腎、胰腺、心臟等器官的損傷具有保護作用[1]。但在硫代乙酰胺（Thioactitmide，TAA）所致急性肝損傷中作用如何，目前研究較少。本實驗旨在探討外源性瘦素在TAA所致急性肝損傷中的作用及機制。

1 材料及方法

1.1 主要試劑

腫瘤壞死因子α（TNF-α）放射免疫試劑盒購于北京尚柏生物醫(yī)學技術有限公司。Trizol試劑購自Sigma公司。逆轉錄試劑盒購自上海生物科技公司。PCR引物基因序列通過GeneBank獲得，設計通過Primor 5.0軟件完成，上海生物工程公司合成。硫代乙酰胺院國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 動物分組及模型制備

36只雄性Wistar大鼠，體重230～250 g，清潔級，由吉林大學醫(yī)學實驗動物中心提供。大鼠分為正常組、TAA造模組及外源性瘦素預處理組，每組12只。TAA造模組予TAA 200 mg/kg腹腔注射，外源性瘦素預處理組于建立急性肝損傷模型前1 h腹腔內注射瘦素 200 mg/kg，造模步驟同TAA造模組；正常組不造模。予同等劑量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射。三組大鼠分別于造模后24 h處死。

1.3 血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、血清天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和腫瘤壞死因子（TNF）水平檢測

血漿標本采用Olympus AU2700生化儀測定ALT和AST濃度，TNF的檢測采用放射免疫法。

1.4 核因子-κB（NF-κB）和 TNF-αmRNA 表達檢測

采用RT-PCR法檢測NF-κB、TNF-αmRNA表達：提取移植肝組織總RNA，取2 μL用于逆轉錄，反應體積為50 μL。PCR 擴增 NF-κB，TNF-αmRNA，以 β-actin作為內參照。引物由上海生工生物制品公司合成。NF-κB，TNF-α mRNA和 β-actin引 物 序 列 分 別 為 ：TNF-α 上 游 5'-CCACGCTCTTCTGTCTACTGT-3'，下游 3'-GCTACGGGCTTGTCACTC-5'，NF-κB 上游 5'-CCAGGCGGACATCATCAA-3'，下游 3'-AGGAAAGTAAACCGGAAC-5'，β -actin： 上 游 5'-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游 3'-CTGGAAGGTGGACAGTGAGG-5'。 反應條件為： 94℃變性 5 min， 94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s， 共擴增 35 個循環(huán)，72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，凝膠成像系統(tǒng)進行掃描，進行半定量分析，以各基因與相應β-actin的PCR產(chǎn)物積分光密度的比值代表半定量值。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用 t檢驗，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外源性瘦素對肝功能的影響

外源性瘦素預處理組ALT、AST水平較TAA造模組降低（P<0.01），較正常組增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 見表1。

表1 造模后24 h各組小鼠ALT、AST水平比較（±s，U/L）

表1 造模后24 h各組小鼠ALT、AST水平比較（±s，U/L）

注：與外源性瘦素預處理組比較，#P<0.01

組別 只數(shù) ALT AST正常組TAA造模組外源性瘦素預處理組12 12 12 47.1±1.7#680.0±364.7#230.2±78.2 146.3±45.2#2 580.0±649.3#980.3±234.1

2.2 各組血漿腫瘤壞死因子α水平比較

瘦素預處理組TNF-α較TAA造模組降低（P<0.01），較正常組增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表2。

表2 造模后24 h各組小鼠血漿TNF-α濃度比較（±s，ng/mL）

表2 造模后24 h各組小鼠血漿TNF-α濃度比較（±s，ng/mL）

注：與外源性瘦素預處理組比較，#P<0.01

組別 只數(shù) TNF-α正常組TAA造模組外源性瘦素預處理組12 12 12 1.23±0.45#13.22±3.14#5.21±0.84

2.3 各組肝組織腫瘤壞死因子α、NF-κBmRNA表達變化的比較

外源性瘦素預處理組肝組織TNF-α、NF-κB mRNA表達較TAA造模組明顯降低（P<0.01）；但較正常組增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表3。

3 討論

瘦素是一種主要由脂肪組織分泌的相對分子質量為16 kDa的蛋白活性因子，含167個氨基酸，由肥胖基因ob編碼，通過下丘腦內的特異受體，受神經(jīng)-內分泌和能量代謝狀況的反饋調節(jié)而表達。正常情況下，瘦素在脂肪組織中維持一定的水平，通過與下丘腦內的特異受體結合參與調節(jié)機體攝食、體質量平衡、新陳代謝和生育功能，還參與了機體應激后內環(huán)境穩(wěn)定的過程，具有廣泛的生物學意義[2]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素在急性炎癥造成的組織損傷中發(fā)揮重要的作用，可能是炎癥反應時細胞因子網(wǎng)絡的組成部分[3]。

表3 造模后24h各組小鼠肝組織TNF-α、NF-κBmRNA的表達變化（±s）

表3 造模后24h各組小鼠肝組織TNF-α、NF-κBmRNA的表達變化（±s）

注：與外源性瘦素預處理組比較，#P<0.01

組別 只數(shù) TNF-α NF-κB正常組TAA處理組外源性瘦素預處理組12 12 12 16.4±3.2#159.23±5.4#48.1±3.8 0.32±0.03#1.5±0.34#0.68±0.11

TAA所致的急性肝損傷，與人類肝損傷的特點最為接近，能較好地反映人類肝損傷的實際情況，是研究急性肝損傷發(fā)生機制最佳的動物模型[4]。NF-κB是一種能與多種細胞基因的κB位點發(fā)生特異性結合并啟動基因轉錄的蛋白質，能夠調控多種與炎性反應有關的細胞因子[5]。TNF-α作為NF-κB的下游基因，在其啟動子上存在著NF-κB的結合位點。TNF-α是炎癥反應中最關鍵的促炎性介質，在急性肝損傷病情進展中起著最關鍵的作用[6]。

本實驗結果表明TAA處理后大鼠肝功能明顯受損，而血漿TNF-α水平明顯升高，與之對應的肝組織中TNF-α和NF-κB的表達明顯增強，外源性瘦素預處理則各組指標明顯較TAA造模組低，但較正常組高。表明外源預處理減輕TAA所致急性肝損傷的機制可能為：急性肝損傷伴發(fā)內毒素血癥[7]，血漿內毒素水平升高，刺激細胞內的轉錄因子NF-κB，使之活化?；罨蟮腘F-κB可增強TNF-α等炎性因子的轉錄，促進TNF-α生成和釋放增多。引起組織內炎性細胞反復浸潤及炎癥反應，造成組織器官損害。瘦素作為一種抗氧化劑，對NF-κB的活化有明顯的抑制作用[8]。用瘦素抑制NF-κB的活性后，直接減少了血漿及肝組織中TNF-α生成，進而減輕了肝損傷，但這種保護機制僅能部分減輕損傷，而不能完全抑制損傷。這表明TAA所致急性肝損傷是多種炎癥介質參與的復雜過程，其全部機制仍待進一步研究。

本文通過外源性瘦素預處理硫代乙酰胺所致的急性肝損傷，觀察其對大鼠急性肝損傷早期炎癥反應的影響，探討該作用的可能機制，深入研究其保護作用機制將有助于瘦素的應用向臨床過渡。

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