RP-HPLC法測(cè)定消痔靈片中沒(méi)食子酸的含量

秦貽強(qiáng) 龔 勛 董曉敏

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林 541001

消痔靈片由五倍子、白蘞、卷柏、地榆、槐花、牛羊膽酸等六味中藥材配伍而成，具有收斂止血、解毒斂瘡的功效，用于內(nèi)外痔瘡[1]。原制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)以膽酸為控制指標(biāo)，目前已有報(bào)道進(jìn)行了消痔靈片中蘆丁的含量測(cè)定研究[2]，然而本研究發(fā)現(xiàn)該制劑中的主藥五倍子、地榆含有沒(méi)食子酸等鞣質(zhì)成分，具有抗菌、抗炎、止血的藥理活性。在治療痔瘡的中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，沒(méi)食子酸[3-4]常被認(rèn)定為指標(biāo)成分來(lái)進(jìn)行含量測(cè)定，因此，本文采用RP-HPLC法對(duì)消痔靈片中的沒(méi)食子酸進(jìn)行含量測(cè)定方法研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；威瑪龍WM2010型通用多媒體色譜工作站；HANGPINGFA2004型電子分析天平（上海精科天平儀器廠）；B2500S-MT型超聲儀（上海必能信超聲有限公司）。

1.2 試藥

消痔靈片（重慶希爾安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100901）；缺五倍子、地榆的陰性對(duì)照樣品為自制。沒(méi)食子酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110831-200302）；甲醇為色譜純，磷酸及其他試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：Sino Chrom ODS-APC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（6∶94∶0.2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm，流速：1.0 mL/min；柱溫：（25±1）℃；進(jìn)樣量：20 μL。 理論板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算，不低于3 000。見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 供試品溶液的制備

取本品10片，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.1 g，置100 mL量瓶中，加6%甲醇90 mL，超聲30 min，放冷，加6%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按消痔靈片的處方制備不含五倍子、地榆藥材的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，制成陰性對(duì)照溶液，備用。

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

以6%甲醇為溶劑對(duì)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品及消痔靈片樣品溶液進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，沒(méi)食子酸在266 nm處有最大吸收，消痔靈片在263 nm處有最大吸收；并將二者進(jìn)注高效液相色譜儀中測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為266 nm時(shí)，峰形均較好，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm。

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品約6 mg，置50 mL量瓶中，加6%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得120 μg/mL對(duì)照品溶液，備用。分別精密吸取對(duì)照品溶液 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL至10 mL量瓶，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=50 070.45X-4 335.895，r=0.999 1。結(jié)果表明，對(duì)照品在18～48 μg/mL濃度范圍呈良好線性關(guān)系。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一濃度的對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定沒(méi)食子酸峰面積平均值，求得RSD=0.39%。表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12 h各進(jìn)樣一次，測(cè)定峰面積積分值。求得RSD=0.55%。表明供試品溶液中沒(méi)食子酸在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品6份，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定沒(méi)食子酸峰面積積分值，求得RSD=2.19%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)供試品約0.05 g，精密稱(chēng)定6份，分別加入適量的沒(méi)食子酸對(duì)照品，按供試品制法制備和上述色譜條件下測(cè)定，平均回收率=99.75%，RSD=0.97%。見(jiàn)表1。

2.7 樣品含量測(cè)定

按上述方法測(cè)定批號(hào)為100901的消痔靈片樣品，平行條件下提取測(cè)定3次，計(jì)算得平均值，求得每片消痔靈片（每片質(zhì)量為0.2 g）含沒(méi)食子酸為6.39 mg/片。

3 討論

消痔靈片的組方中，五倍子、地榆與白蘞三種藥材均含有沒(méi)食子酸，而沒(méi)食子酸具有的抗菌、抗炎、抗病毒等作用與消痔靈片抗菌、抗炎、止血的功效相吻合[5]。消痔靈片的原標(biāo)準(zhǔn)建立了以五倍子、地榆對(duì)照藥材及蘆丁對(duì)照品的薄層色譜定性鑒別，含量測(cè)定項(xiàng)選擇了膽酸為測(cè)定指標(biāo)，未能很好體現(xiàn)該制劑中有效成分沒(méi)食子酸的含量控制。因此為更好地控制消痔靈片的質(zhì)量，本研究在其原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法測(cè)定了沒(méi)食子酸總含量，為綜合評(píng)價(jià)該制劑的內(nèi)在質(zhì)量及開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表1 沒(méi)食子酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

本文在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以甲醇溶液制備的沒(méi)食子酸對(duì)照品的色譜峰峰形不佳，而以含甲醇-磷酸的水溶液制備的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液和供試品溶液則峰形良好。以甲醇溶液、6%甲醇、30%甲醇、50%甲醇四種溶劑的提取效率，結(jié)果表明，甲醇溶劑提取率較低，其他三溶劑的得率無(wú)明顯差異，但用6%甲醇提取的溶液雜質(zhì)較少，顏色較淺，因此選擇6%甲醇為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)中曾觀察到柱溫的變化會(huì)影響不同圖譜中同一色譜峰的保留時(shí)間，為獲得重現(xiàn)性較好的色譜圖及相應(yīng)的峰面積，必須保持柱溫恒定。

[1]中國(guó)藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：275.

[2]王寶琴.中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1994：106.

[3]杜敏，顏仁梁.HPLC法測(cè)定復(fù)方鹽膚木化痔膠囊中沒(méi)食子酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22（1）：102-104.

[4]毛長(zhǎng)智，張赟赟，甘露.HPLC法測(cè)定消痔軟膏中沒(méi)食子酸的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，16（9）：99-100.

[5]陳新玉，李健和，黎銀波，等.地榆、地榆片、地榆炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8（17）：64-67.