鴨病毒性肝炎(DVH)精制蛋黃抗體的治療效果試驗

，，， ，黃建，

(余姚市禽畜病防治研究所，浙江余姚 315400)

鴨病毒性肝炎(DVH)由鴨甲肝病毒(DHAV)和星狀病毒(DAstV)[1]引起的雛鴨急性、高致死性傳染病，嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。

本病主要危害4周齡內(nèi)的雛鴨，以1周齡左右的雛鴨最為高發(fā)[2]。其特點為發(fā)病急、病程短、死亡率高，臨床表現(xiàn)痙攣、角弓反張等特征性癥狀，剖檢特征性病變主要集中在肝臟(腫大、柔軟和出血)，嚴重者肝臟有刷狀出血斑[3]。

浙東地區(qū)是我國重要的水禽養(yǎng)殖地區(qū)，不僅麻鴨與北京鴨經(jīng)常爆發(fā)DVH，而且番鴨也時有發(fā)生，嚴重危害了養(yǎng)鴨業(yè)的正常發(fā)展。

近年來，蛋黃抗體制品逐漸受到人們的關注，并逐步應用到禽病防制領域。本試驗選擇商業(yè)化的DVH精制蛋黃抗體進行試驗，研究其治療效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1試驗動物 10日齡鴨胚和1日齡雛麻鴨購自余姚市某種鴨場。

1.2病毒 余姚市禽畜病防治研究所實驗室分離并鑒定的DHAV。分別為DHNB1、DHNB2、DHNB3、DHNB4和DHNB5。

1.3試劑 DVH精制蛋黃抗體，由河南洛陽某生物工程有限公司生產(chǎn)，批號：(2009)160022148，預防建議用量0.5 mL/羽，治療建議用量0.7～1.0 mL/羽。

1.4方法

1.4.1分離毒株半數(shù)致死量(ELD50)的測定 選用保存的分離毒株接種10日齡鴨胚擴大培養(yǎng)，收集24-96 h死亡胚體和尿囊液混勻勻漿后過濾分裝冷凍保存，取其中1份按照《動物病毒學》(第二版)[4]的方法測定ELD50，連續(xù)成7個稀釋度，每個稀釋度接種4枚鴨胚，置37℃溫箱孵化，每天照蛋記錄死胚數(shù)，觀察144 h，按Reed和Muench法計算ELD50。

公式：lgELD50=高于50%病毒稀釋度對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)對數(shù)

1.4.2鴨胚中和試驗 參照《動物免疫學》(第二版)[5]的方法，根據(jù)各個分離毒株ELD50測定結(jié)果進行稀釋，使最終濃度為200 ELD50/0.2 mL，然后與倍比稀釋的DVH精制蛋黃抗體等體積混合，37℃作用1 h，每個稀釋度接種鴨胚4枚，接種量為0.2 mL/枚。每天觀察統(tǒng)計鴨胚死亡情況，連續(xù)觀察144 h，以終點法計算中和滴度，即能使鴨胚不死亡的DVH精制蛋黃抗體最高稀釋倍數(shù)為中和滴度[6]。

1.4.3攻毒保護實驗 1日齡健康雛鴨90羽,平均分為18組，每組5羽，具體處理操作詳見表1。飼養(yǎng)至3日齡時進行攻毒，嚴格隔離飼養(yǎng)，任其自由采食，攻毒后24 h和48 h按照試驗計劃注射DVH精制蛋黃抗體，每天觀察發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察1周。

出現(xiàn)精神沉郁和共濟失調(diào)、痙攣和角弓反張等神經(jīng)癥狀的雛鴨，判定為發(fā)病；未見神經(jīng)癥狀的存活雛鴨判定為被保護。

1.4.4臨床推廣和應用 根據(jù)實驗結(jié)果，門診引進普萊柯公司生產(chǎn)的DVH精制蛋黃抗體進行臨床推廣試驗。門診送檢病例解剖診斷為DVH的，給予該產(chǎn)品治療，建議注射劑量1.0ml/羽，就診時發(fā)病率和死亡率較高的場和曾經(jīng)發(fā)生過DVH的場，建議連續(xù)注射2 d，選擇部分養(yǎng)殖場1周后回訪。

2 試驗結(jié)果

2.1ELD50測定結(jié)果 詳見表2。

表1 攻毒保護試驗分組情況

表2 DHV分離毒株ELD50測定結(jié)果

根據(jù)Reed和Muench法，計算獲得各個毒株ELD50。結(jié)果顯示，DHV寧波分離毒株ELD50均較高，最高可達108.5/0.2 mL。

2.2鴨胚中和試驗結(jié)果 詳見表3。

表3 DVH精制蛋黃抗體與各個分離毒株中和試驗結(jié)果

觀察144 h后，根據(jù)鴨胚死亡情況計算得DVH精制蛋黃抗體與各個分離毒株的中和滴度。結(jié)果顯示，DVH精制蛋黃抗體與分離毒株中和效果最高達1∶512，最低1∶64，抗體效價較高。

2.3攻毒保護試驗結(jié)果 詳見表4。

表4 DVH精制蛋黃抗體攻毒保護試驗結(jié)果

試驗雛鴨攻毒后24 h，均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、共濟失調(diào)和痙攣及角弓反張等癥狀。

按計劃對部分試驗鴨通過肌肉或皮下注射0.7 mL和1.0 mL DVH精制蛋黃抗體，結(jié)果使用DVH精制蛋黃抗體的試驗鴨死亡率明顯降低，且神經(jīng)癥狀較攻毒不注射抗體制品的試驗鴨明顯好轉(zhuǎn)和輕微。其中1.0 mL劑量組對雛鴨的保護率最高達100%，最低為80%，0.7 mL劑量組對雛鴨的保護率介于60%和100%之間，1.0 mL劑量對雛鴨的保護效果明顯高于0.7 mL劑量組。

攻毒不注射抗體制品組的試驗鴨死亡率60%～100%(即保護率0%～40%)。

生理鹽水對照組、1.0 mL抗體劑量組和0.7 mL抗體劑量組的試驗鴨無發(fā)病現(xiàn)象。

2.4臨床推廣應用結(jié)果 詳見圖1、圖2。

根據(jù)余姚市禽畜病防治研究所家禽門診統(tǒng)計結(jié)果顯示，2010年1月至2011年8月，該市每月均有數(shù)量不等的雛鴨發(fā)生病毒性肝炎。其中2010年發(fā)病鴨共220 260羽，2011年，共85 090羽，臨床推廣使用DVH精制蛋黃抗體50萬mL。

回訪結(jié)果顯示，使用DVH精制蛋黃抗體后能明顯減少DVH發(fā)病鴨的死亡率。

圖1 2010年鴨肝炎發(fā)病情況

圖2 2011年鴨肝炎發(fā)病情況

3 討論

3.1鴨肝炎病毒研究情況 鴨肝炎病毒，是DVH的病原，按照血清交叉中和關系曾分為3個血清型，分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[7]。目前將其分為鴨甲肝病毒和鴨星狀病毒[8]，其中鴨甲肝病毒隸屬于小RNA病毒科禽肝病毒屬，分別對應血清Ⅰ型、“臺灣新型”[9]和“韓國新型”[10]；鴨星狀病毒隸屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬，對應傳統(tǒng)的血清Ⅱ型和Ⅲ型[7]。不同基因型的病毒，其基因差異較大[11]，不同血清型的毒株之間亦無交叉保護性，給該病的預防和治療帶來了較大難度。

目前，市場上DVH的治療抗體制品繁多，本試驗從臨床采集發(fā)病鴨的肝臟分離寧波地區(qū)的流行毒株，通過中和試驗和攻毒保護試驗篩選出適用于本地的抗體制品，為有效預防和治療DVH提供了科學參考數(shù)據(jù)。

3.2DVH的預防 目前主要通過加強飼養(yǎng)管理(即從消滅傳染源、切斷傳播途徑和保護易感動物)、給予全價飼料，增強雛鴨體質(zhì)以達到預防目的[12]。對于DVH高發(fā)鴨場和養(yǎng)殖地區(qū)，還應做好疫苗免疫接種。

種鴨免疫：一般采用活疫苗免疫產(chǎn)蛋母鴨，開產(chǎn)前2-4周肌內(nèi)注射雞胚化弱毒疫苗，雛鴨可通過卵黃獲得母源抗體，在早期可有效抵抗鴨肝炎病毒的感染。這是一種目前采用，最方便、有效的預防方法。

雛鴨免疫：對有母源抗體的雛鴨，應在7～10日齡使用弱毒疫苗免疫，每羽皮下接種2～3羽份；對已經(jīng)注射蛋黃抗體的雛鴨，應在注射后7 d再進行疫苗注射。對無母源抗體的雛鴨，應在出殼后1～3 d(最好在出殼后24 h內(nèi))進行疫苗免疫接種[13]。

另外，可采用DVH精制蛋黃抗體注射，使雛鴨獲得被動免疫能力[13]。DVH在生產(chǎn)中廣泛存在，由于生產(chǎn)中雛鴨DVH母源抗體較低且不均勻，所以在雛鴨出殼當日或盡早注射補充抗體是有效預防本病的方法。

普萊柯DVH精制蛋黃抗體建議使用劑量為0.5～1.0 mL/羽。本試驗結(jié)果表明，1.0 mL/羽劑量能更好的保護發(fā)病雛鴨，因此建議在臨床中預防建議劑量為0.5 mL/羽；發(fā)病鴨群則建議使用1.0 mL/羽劑量，采用肌內(nèi)或頸背皮下注射進行治療。如果鴨場曾經(jīng)發(fā)病或發(fā)病率和死亡率較高，則建議連續(xù)注射2次，以確保治療效果。

使用DVH精制蛋黃抗體預防和治療DVH的同時，還應加強飼養(yǎng)管理，在飼料中添加電解多維，降低飼料中粗蛋白含量，提供適宜的保溫條件，充足飲水，有條件者可給予黃芪多糖飲水，避免各種應激反應。

3.3蛋黃抗體在家禽生產(chǎn)中的應用 蛋黃抗體是蛋中的免疫球蛋白，具有良好的穩(wěn)定性。據(jù)報道，蛋黃抗體在4℃儲存5-10年抗體活性均未發(fā)生明顯的改變，在室溫下保存半年仍具有良好的活性。這給蛋黃抗體的生產(chǎn)和應用提供了良好的前提條件[14]。

研究表明，蛋黃抗體在治療沙門氏菌、彎曲桿菌、壞死性腸炎、大腸桿菌病、傳染性法氏囊病和雞新城疫等均具有良好效果。

近20年來，特異性蛋黃抗體在動物疾病預防中的作用已廣為所知，但在家禽生產(chǎn)中實現(xiàn)商業(yè)化應用的規(guī)模仍有待提高。目前所知蛋黃抗體是治療病毒性疾病、抵御細菌耐藥性、替代抗生素的最佳產(chǎn)品。因此，在家禽生產(chǎn)中研制、推廣和應用蛋黃抗體具有廣闊的前景。

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