人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因轉(zhuǎn)染對犬髓核細胞生物學活性的影響

辛洪奎，張 超，王德利，吳劍宏，王超峰，何 勍，阮狄克

椎間盤退變所導致的椎間盤突出、椎管狹窄等疾病是臨床常見病。傳統(tǒng)外科治療手段存在可能的穩(wěn)定性丟失及相鄰節(jié)段退變等不足。近年來再生醫(yī)學的迅速發(fā)展，啟發(fā)了從事骨科臨床及基礎(chǔ)研究工作的學者們以重建的角度審視椎間盤退行性疾病，積極探索通過生物技術(shù)修復甚至重建病變的椎間盤，以期在不遠的將來代替?zhèn)鹘y(tǒng)治療措施。椎間盤退變最為重要的機制就是髓核組織內(nèi)細胞數(shù)量的減少及活性的降低[1]，從這一角度來說，通過補充退變髓核內(nèi)的細胞數(shù)量來修復椎間盤退變是良好的選擇。本課題小組前期開展了以髓核細胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)修復退變椎間盤的探索性研究[2]，研究結(jié)果提示通過組織工程手段將髓核細胞植入退變椎間盤內(nèi)的確可以起到延緩退變的效果。雖然髓核細胞增殖能力的有限性及其體外培養(yǎng)的去分化現(xiàn)象限制了其在這一領(lǐng)域的應用前景[3-4]，但天然髓核細胞表型的固有優(yōu)越性是其他細胞來源如骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞無法比擬的，因此需通過適當?shù)募夹g(shù)手段促進髓核細胞的活性及其增殖能力。

本研究通過人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉(zhuǎn)染的方式將外源性基因?qū)胨韬思毎?，以期獲得增殖能力及生物學活性更強的細胞作為椎間盤退行性疾病生物治療的種子細胞。在完成基因轉(zhuǎn)染后，擬通過目的基因表達及細胞功能蛋白表達水平評估hTERT基因?qū)θ韬思毎飳W活性的影響。

1 材料與方法

1.1 犬髓核細胞的體外培養(yǎng) 8周齡幼犬，肌內(nèi)注射氯胺酮與速眠新麻醉，按背部正中切口備皮及消毒，切開皮膚及皮下組織，分離椎旁肌，切斷肋骨，離斷胸段及腰段脊柱，水平切開椎間盤，刮取膠凍狀髓核置于15 ml離心管中，2 g/L膠原酶(GIBCO公司，美國)消化2 h后1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗 2 次，收集細胞接種于100 ml培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的F12培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國)，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察生長情況。細胞貼壁生長后換液，每周換液2次，細胞融合單層后傳代，取傳2代細胞作為種子細胞進行基因轉(zhuǎn)染。

1.2 rAAV2-hTERT體外轉(zhuǎn)染髓核細胞 本實驗所使用2型重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus type-2，rAAV2)-hTERT病毒載體由北京五加和生物技術(shù)有限公司完成。病毒滴度=1×1012cfu/ml。實驗分組:實驗組用 rAAV2-hTERT病毒載體以復合感染(multiplicity of infection，MOI)為1×105v.g/cell轉(zhuǎn)染犬髓核細胞;rAAV2-EGFP(enhanced green fluorescent protein，增強綠色熒光蛋白)病毒以相同的MOI轉(zhuǎn)染髓核細胞作為陰性對照。具體的轉(zhuǎn)染方法:6孔板內(nèi)單層培養(yǎng)的傳2代髓核細胞達80%融合后，棄去上清，PBS漂洗3次，取1孔細胞消化計數(shù)以確定每個培養(yǎng)孔所需病毒數(shù)量。向每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入適量病毒使得轉(zhuǎn)染復數(shù)保持于1×105v.g/cell。向每孔內(nèi)加入達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)2 ml，37℃，5%CO2，飽和濕度下孵育 2 h 完成病毒轉(zhuǎn)染。2 h后棄去上清，PBS漂洗3次，10%FBS，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細胞3 d換液1次，轉(zhuǎn)染后5 d起激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad Radiance 2100TMconfocal system in conjunction with a Nikon TE300 microscope)觀察EGFP表達情況。

1.3 轉(zhuǎn)基因髓核細胞hTERT蛋白及mRNA的表達

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測 hTERT mRNA的表達 在轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d以及60 d分別收集實驗組及對照組細胞，Trizol法提取總RNA。利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶random dT primer和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在42℃條件下孵育1 h，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板在PCR儀上進行PCR反應檢測基因轉(zhuǎn)染后髓核細胞hTERT mRNA的表達，選擇犬甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參。RT-PCR引物序列為:

對于PCR產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色后紫外燈下觀測，hTERT mRNA的陽性表達可擴增出128 bp的陽性條帶。采集結(jié)果，并進行目的條帶與內(nèi)參條帶之間的灰度值比較，對結(jié)果進行半定量分析。

1.3.2 Western-blot檢測hTERT蛋白的表達 轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d以及60 d分別收集實驗組及對照組細胞，冷PBS洗滌3次后加入預冷的細胞裂解液裂解(1%髓核細胞40.20 mmol/L三羥甲基氨基甲烷 Tris pH 7.4，150 mmol/L NaC1，10% 甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，10 ml抑菌肽，1 g/ml亮肽素，500 mmol/L正礬酸鈉)?；靹?，冰上放置30 min后4℃ 12 000×g離心20 min，提取總蛋白，Bio-Rad酶定量法蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度一致。94℃變性10 min。配制150 L的聚丙烯酰胺分離膠，每孔上樣60 μg蛋白，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂牛奶封閉l h后，以鼠抗 hTERT(Abcam公司，美國)單克隆抗體4℃孵育過夜。Tris緩沖液(Tris buffered saline，TBS)/0.1%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯(Tween)-20洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠(1∶2 000)，37℃孵育l h，TBS/0.1%Tween-20洗膜后，用增強化學發(fā)光法檢測目的條帶的表達。圖像掃描進行Western blot免疫印跡分析。另配置120 g/L的分離膠，按傳統(tǒng)方法作為內(nèi)參GAPDH的Western-blot免疫印跡。以發(fā)光條帶的灰度值進行半定量分析。

1.4 實時定量PCR法檢測PG及COL1、COL2 mRNA含量 實時定量(real-time quantitative)PCR法是目前被廣泛應用的具有較高準確性及較強可重復性的檢測目的基因mRNA表達的方法。其原理為SYBR Green熒光染料在雙鏈DNA中可發(fā)出熒光，且熒光強度在一定范圍內(nèi)與DNA雙鏈數(shù)量成正比。通過使用實時定量PCR熱循環(huán)儀(MinOpticon real-time PCR，Bio-Rad)檢測熒光強度對mRNA含量進行半定量分析。本研究選擇對基因轉(zhuǎn)染后的髓核細胞表達的PG及COL1、COL2 mRNA行實時定量PCR分析。在轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d以及60 d分別收集實驗組及對照組細胞，細胞各自混勻后，Trizol法提取各組RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法同前，以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進行操作，ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行PCR反應。使用GAPDH作為內(nèi)參對PG及COL1、COL2 mRNA的含量進行標準化。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達量 于基因轉(zhuǎn)染后的5、10、15、30 d以及60 d，收集達80%～90%融合的細胞培養(yǎng)液上清2 ml，每組細胞平均取3孔細胞培養(yǎng)上清，將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain deried neurotrophic factor，BDNF)標準品和細胞培養(yǎng)上清液加人96孔板，每個樣品設3個復孔。牛Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白(Sigma-Aldrich公司，美國)溶液配制Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白標品，分別加入96孔板。4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS和0.5%Tween-20洗滌后1%牛血清室溫下封閉1 h。0.01 mol/L PBS和0.5%Tween-20洗滌，以鼠源性Ⅰ型、Ⅱ型膠原單克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司，美國)室溫下孵育2 h，0.01 mol/L PBS和 0.5%Tween-20洗滌。抗鼠 IgG抗體 (Sigma-Aldrich公司，美國)室溫下孵育1 h，再次洗滌后，以交聯(lián)磷酸酶的生物素(Sigma-Aldrich公司，美國)孵育1 h，每孔中加入p-nitrophenyl phosphate(Sigma-Aldrich公司，美國)20 μl孵育 20 min，3 mol/L NaOH 中和反應，置入酶標儀(Bio-Rad公司，美國)中，讀取405 nm處吸光度，按繪制的標準曲線計算各樣本中Ⅱ型膠原及蛋白多糖含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，各組均數(shù)間的比較用方差分析，均數(shù)間兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 犬髓核細胞的分離培養(yǎng)及熒光標記 8周齡幼犬髓核呈半透明膠凍狀。經(jīng)膠原酶消化2 h后，大量椎間盤細胞可被分離出來形成細胞懸液。接種培養(yǎng)瓶后48 h內(nèi)細胞即可貼壁伸展。鏡下可見細胞胞質(zhì)豐富，胞體飽滿，呈短梭形，有2個或2個以上長短不一的突起，并隨培養(yǎng)時間延長而向外延展(圖1)。原代椎間盤細胞生長迅速，培養(yǎng)1周即可鋪滿瓶底80%，達到傳代要求。隨傳代次數(shù)增加，細胞極性逐漸增強，呈長梭形，似成纖維細胞，生長變緩。

圖1 傳2代犬髓核細胞

2.2 rAAV2病毒載體體外轉(zhuǎn)染髓核細胞 以rAAV2-EGFP作為標記基因的測定結(jié)果顯示，使用rAAV2可成功轉(zhuǎn)染犬髓核細胞，EGFP可在被轉(zhuǎn)染髓核細胞中正確表達。在轉(zhuǎn)染后的第10天，EGFP的表達達到高峰，隨著細胞傳代次數(shù)的增加，其表達量逐漸減低，至第30天時其表達量明顯減少(圖2)。rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細胞后5 d，即可檢測到hTERT mRNA及蛋白的表達，而陰性對照組未檢測到相應mRNA及蛋白的表達(圖3、4)。

2.3 hTERT基因表達結(jié)果的動態(tài)檢測 在轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d 以及 60 d，均可于基因和蛋白水平檢測到hTERT基因在髓核細胞內(nèi)的表達，而在所有觀察時間點內(nèi)，對照組未能檢測到hTERT基因表達。通過對不同時間點的實驗組細胞進行目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比較顯示，轉(zhuǎn)染后第10天hTERT基因的表達的相對水平最高，而隨著細胞傳代次數(shù)的增加，hTERT基因表達的相對水平也逐漸降低(圖5)。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP在髓核細胞中的表達

圖3 RT-PCR檢測rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后5 d髓核細胞hTERT mRNA的表達

圖4 Westernblot檢測rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后5 d髓核細胞hTERT蛋白的表達

圖5 實驗組髓核細胞hTERT基因表達結(jié)果的動態(tài)觀察

2.4 實時定量PCR法檢測PG及COL1、COL2 mRNA含量 實時定量PCR檢測結(jié)果顯示:rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后第5天，實驗組細胞PG及COL1、COL2 mRNA含量較EGFP對照組未見明顯增加;而在轉(zhuǎn)染后的第10天，實驗組PG、COL2 mRNA的表達量分別較對照組增加了62%和50%(P＜0.05);而這一mRNA表達量的增加在隨后的觀察中繼續(xù)升高，在第15天分別達到了最高的132%和87%(P＜0.05)。15 d后，雖然mRNA表達量增加的幅度較最高峰有所下降，但仍明顯高于對照組細胞的mRNA表達(P＜0.05)。而對COL1 mRNA表達的分析可見雖然實驗組髓核細胞轉(zhuǎn)染后COL1 mRNA表達量有小幅增加，但同對照組相比無明顯差別，結(jié)果無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖6。

圖6 PG及COL1、COL2 mRNA表達量的實時定量PCR分析

2.5 蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達量的檢測 通過ELISA法對蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達量的分析提示:rAAV-hTERT在轉(zhuǎn)染后第5天，實驗組細胞PG、COL2的表達量較EGFP對照組未見明顯增加;而在轉(zhuǎn)染后的第10天，實驗組PG、COL2的表達量顯著增加，并在第15天達到52.48 ng/ml及4.69 ng/ml的高值。在30 d和60 d時，實驗組PG、COL2的表達量仍維持在較高水平;對照組細胞隨著培養(yǎng)時間及代次的延長，在第30天后蛋白多糖表達量出現(xiàn)較為明顯的下調(diào)。通過單因素方差分析進行兩組間的統(tǒng)計比較，自第10天至第60天，實驗組PG、COL2的表達量均明顯高于對照組(P＜0.05)。見圖7、8。

圖7 PG表達量的ELISA分析

圖8 COL2表達量的ELISA分析

3 討論

許多因素在椎間盤退變的過程中發(fā)揮重要作用，包括年齡、吸煙、喝酒、機械應力、營養(yǎng)缺乏以及遺傳因素等[5-7]。椎間盤退變的實質(zhì)是椎間盤組織及細胞在這些因素的作用下所產(chǎn)生的一系列復雜病理生理改變。首先出現(xiàn)的是髓核內(nèi)細胞數(shù)量的不足或由于缺乏足夠的營養(yǎng)導致的細胞功能的下降[8]，這引起細胞外基質(zhì)成分Ⅱ型膠原及蛋白多糖等表達量的降低，從而導致髓核及纖維環(huán)組織強度及韌性的減低，在外力的作用下更易發(fā)生纖維環(huán)或髓核組織的破壞，繼發(fā)椎間盤突出、椎管狹窄等退變相關(guān)疾病，引起臨床癥狀，從而影響患者工作及生活。

運用生物技術(shù)手段延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的進展，從結(jié)構(gòu)及功能上實現(xiàn)椎間盤的修復重建，理論上具有巨大的優(yōu)勢。椎間盤退變最直接的原因在于椎間盤內(nèi)細胞數(shù)量的減少及活力的下降。因此，通過生物技術(shù)增強椎間盤內(nèi)細胞的活力或直接增加細胞的數(shù)量具有相當?shù)目尚行浴?/p>

20世紀90年代醫(yī)學研究成果證實[9-10]，端粒長度會隨著細胞的分裂增殖而逐漸縮短，細胞每增殖1倍，端粒長度可能會損失50～200個核苷酸，而當端粒縮短到一定程度時，則會導致細胞的死亡[11]。端粒酶是一種RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復合體，具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，它能以自身RNA(人端粒酶反向hTR)為模板，從頭合成端粒DNA并加到染色體末端，維持染色體的穩(wěn)定性[12]。運用hTERT來延長細胞的生命周期是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新促進細胞增殖的方法。迄今為止學者們已經(jīng)利用hTERT基因成功構(gòu)建了多種組織“永生化”細胞[13-14]。同時，相關(guān)研究表明hTERT基因轉(zhuǎn)染在促進細胞生物學活性的同時可有效避免致瘤性的出現(xiàn)[15]。本實驗借鑒上述研究的成功經(jīng)驗，擬通過 rAAV2病毒將hTERT基因轉(zhuǎn)入髓核細胞，以期促進髓核細胞的增殖能力及表型維持，為椎間盤退行性疾病的生物治療提供較為理想的種子細胞選擇。通過轉(zhuǎn)染后第5天對實驗組細胞hTERT基因及蛋白表達的分析，證實rAAV2-hTERT病毒載體可成功轉(zhuǎn)染犬髓核細胞并實現(xiàn)表達hTERT基因及蛋白的目的。

永生化細胞的實質(zhì)是細胞獲得了無限增殖的能力。從這一意義上來說，除了腫瘤細胞之外，目前多數(shù)“永生化”的細胞都只是相對的，即細胞的增殖潛能被相對放大，并非真正意義上的永生化。本研究使用rAAV2-hTERT病毒載體轉(zhuǎn)染髓核細胞的目的在于使髓核細胞獲得更長的生命周期，在其生命周期內(nèi)，可以更好地維持細胞表型，實現(xiàn)更長時間的功能表達，而不是一味追求將其“永生化”。實驗中我們發(fā)現(xiàn)rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后的60 d之內(nèi)，hTERT基因及蛋白的表達得到了很好的保持，其高峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后的第10天，雖然此后有一定程度下降，但在第60天仍可以明顯地觀察到其陽性表達。我們認為hTERT基因及蛋白表達在第10天之后出現(xiàn)下調(diào)的原因在于隨著培養(yǎng)時間的延長及傳代次數(shù)的增加，rAAV2-hTERT陽性轉(zhuǎn)染細胞逐漸丟失，從而降低了其調(diào)節(jié)髓核細胞活性的效率。峰值之后hTERT基因及蛋白表達的下行趨勢進一步證實使用rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細胞無法實現(xiàn)真正意義的永生化，而是相對于未處理的髓核細胞，獲得了更長的生命周期。

hTERT基因轉(zhuǎn)染髓核細胞及其mRNA與蛋白的表達只是本研究的第一步，基因轉(zhuǎn)染的目的是獲得活力更強的種子細胞以進一步探索椎間盤退行性疾病的生物治療。同對照組相比，實驗組細胞Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達量的顯著上調(diào)充分驗證了hTERT蛋白對于體外培養(yǎng)的髓核細胞表型及功能的良好維持。Ⅱ型膠原和蛋白多糖是椎間盤細胞外基質(zhì)的重要組成成分，當髓核細胞由于發(fā)生退變而導致兩者表達量下降時，椎間盤的結(jié)構(gòu)和形狀就會發(fā)生改變，從而降低其吸收和分散負荷的能力，在長期機械負荷的作用下，退行性變進一步進展，從而形成椎間盤退變的惡性循環(huán)[8，16]。本實驗中，通過hTERT基因的作用，我們實現(xiàn)了體外培養(yǎng)髓核細胞Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達量的提高，這一結(jié)果對于rAAV2-hTERT-髓核細胞在椎間盤退行性疾病治療中的應用具有相當?shù)囊饬x。通過對實驗結(jié)果的RTPCR半定量及ELISA定量分析，可見兩者表達量在轉(zhuǎn)染后的第15天達到高峰，這一峰值較hTERT基因及蛋白表達高峰相對滯后，可能原因在于hTERT主要通過保證細胞增殖過程中的端粒長度來維持細胞的正常代謝，同時上調(diào)細胞周期中同細胞增殖、DNA修復及染色質(zhì)重組相關(guān)的基因表達水平[17-18]，這些機制傳到細胞蛋白的表達需要相對較為緩慢的過程。因此，在以Ⅱ型膠原及蛋白多糖為指標衡量細胞表型及功能時，其表達量的提升要相對滯后。但hTERT基因?qū)τ诩毎δ艿恼{(diào)節(jié)和保持效果具有相對的持續(xù)性，這反應在至第60天時，實驗組Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達量仍明顯高于對照組。正常髓核細胞少量表達Ⅰ型膠原。通過RT-PCR對不同時間點Ⅰ型膠原表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)實驗組同對照組無明顯區(qū)別，說明rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染對髓核細胞Ⅰ型膠原的表達無明顯促進或抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示rAAV2-hTERT病毒轉(zhuǎn)染可成功實現(xiàn)體外培養(yǎng)條件下髓核細胞增殖能力及細胞功能蛋白表達的上調(diào)，這將可能提高其在椎間盤退行性疾病中的應用潛力。

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