申 欣, 田 美, 孟學(xué)平, 程漢良, 李士虎

(淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005)

與單個(gè)基因或者基因的片段相比, 線粒體基因組是一個(gè)完整的體系, 具有信息量豐富和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn), 在過(guò)去的十幾年間已被廣泛應(yīng)用于后生動(dòng)物分子系統(tǒng)演化和種群遺傳的研究[1-2]。尾索動(dòng)物隸屬于脊索動(dòng)物門(Chordata)、尾索動(dòng)物亞門(Tunicata或者Urochordata), 為海洋生境中所特有的生物類群, 廣泛棲息于世界各大海洋中, 從潮間帶至深海均有分布。由于尾索動(dòng)物在后生動(dòng)物進(jìn)化中處于特殊的關(guān)鍵位置, 其在免疫學(xué)、胚胎發(fā)育學(xué)、細(xì)胞學(xué)等各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域?qū)ρ芯考棺祫?dòng)物的起源與系統(tǒng)發(fā)育都有著不可取代的作用[3-4]。在GenBank線粒體基因組的數(shù)據(jù)庫(kù)中, 目前有12個(gè)尾索動(dòng)物的線粒體基因組全序列。作者在12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組研究的基礎(chǔ)上, 全面分析此類群線粒體基因組的基本特征、基因排列、蛋白質(zhì)編碼基因、選擇壓力、變異位點(diǎn)和分子系統(tǒng)發(fā)育等。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從GenBank線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索、下載得到12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組全序列。分別是隸屬于海鞘綱(Ascidiacea)、內(nèi)性目(Enterogona)的燈泡簇海鞘(Clavelina lepadiformis)、群體海鞘(Diplosoma listerianum)、胃海鞘(Aplidium conicum)、黑色次口海鞘(Phallusia fumigata)、具疣次口海鞘(Phallusia mammilata)、玻璃海鞘(Ciona intestinalis)和薩氏海鞘(Ciona savignyi), 褶鰓目(Stolidobranchia)的真海鞘(Halocynthia roretzi)、莫馬斯赫海鞘(Herdmania momus)、小海鞘(Microcosmus sulcatus)和皺瘤海鞘(Styela plicata)以及樽海鞘綱(Thaliacea)的樽海鞘(Doliolum nationalis)[5-11]。

1.2 選擇壓力分析

為了檢驗(yàn)選擇壓力對(duì)于尾索動(dòng)物(以玻璃海鞘屬為代表)線粒體基因組的影響, 通過(guò) Clustal X[12]對(duì)線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)。同義替換率(Ks)和非同義替換率(Ka)通過(guò)PAML[13]和DnaSP 4.10.7[14]進(jìn)行了估算。

1.3 基因變異特征分析

分別以12個(gè)尾索動(dòng)物、2個(gè)玻璃海鞘屬物種(玻璃海鞘和薩氏海鞘)和 2個(gè)次口海鞘屬物種(黑色次口海鞘和具疣次口海鞘)線粒體基因組作為數(shù)據(jù)群進(jìn)行了基因變異位點(diǎn)分析, 蛋白質(zhì)編碼基因和核糖體RNA基因的核苷酸序列通過(guò)Clustal X[12]進(jìn)行多重序列比對(duì)。然后通過(guò)DnaSP 4.10.7[14]分析了線粒體基因組主編碼基因變異位點(diǎn)特征。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

線粒體基因組 12個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(由于部分物種atp8缺失, 所以將其排除在外)的氨基酸序列通過(guò)Clustal X[12]進(jìn)行多重序列比對(duì)。然后, 通過(guò)兩種方法(貝葉斯法和最大似然法)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建,使用的軟件分別為MrBayes[15]和PHYML[16]。在貝葉斯分析中, 馬爾可夫鏈需要運(yùn)行1 000 000個(gè)世代(構(gòu)樹(shù)頻率=1000世代), 從而保證達(dá)到收斂, 并估算貝葉斯的先驗(yàn)概率(以 BPP表示)。在最大似然法中,通過(guò)自展法(Bootstrap＝1000)評(píng)估節(jié)點(diǎn)的可靠性(以BPM表示)。

2 結(jié)果和討論

2.1 線粒體基因組的基本特征

在脊椎動(dòng)物線粒體基因組中,nad6基因和一系列轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因通常在負(fù)鏈上編碼。在頭索動(dòng)物線粒體基因組中, 也存在與脊椎動(dòng)物線粒體基因組類似的基因分布特征[17-18]。然而, 12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組的所有基因均在同一鏈上編碼, 這與脊椎動(dòng)物、頭索動(dòng)物線粒體基因組的基因分布特征顯著不同。

尾索動(dòng)物線粒體基因組長(zhǎng)度介于13 648bp(群體海鞘)和 16 351bp(樽海鞘)之間。尾索動(dòng)物線粒體基因組的基因組成與后生動(dòng)物線粒體基因組標(biāo)準(zhǔn)的基因組成并不完全一致, 存在轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因數(shù)目的增加, 同時(shí)在燈泡簇海鞘、薩氏海鞘和真海鞘的線粒體基因組中缺乏atp8基因(表1)。線粒體基因組主編碼鏈的A＋T含量差別很大, 最高的達(dá)到80.8%(群體海鞘), 最低的僅為52.9%(具疣次口海鞘)。尾索動(dòng)物線粒體基因組的基本特征見(jiàn)表1。

表1 尾索動(dòng)物線粒體基因組的基本特征Tab. 1 Basic features of tunicates mitochondrial genomes

2.2 基因排列

在12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組中, 發(fā)生了大規(guī)模的基因重排。即使排除容易發(fā)生易位的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因, 它們的基因排列順序也顯著不同(圖 1)。在同屬物種的線粒體基因組中, 也存在主編碼基因的基因重排和基因缺失。在玻璃海鞘屬, 與玻璃海鞘線粒體基因組相比, 薩氏海鞘的nad1基因發(fā)生易位, 同時(shí)atp8基因發(fā)生了缺失(圖1)。在次口海鞘屬, 僅存在 2個(gè)保守的基因區(qū)塊: (1)cox2-cob和(2)nad2-nad4L-cox3, 而其他基因的排列順序均發(fā)生了改變(圖1)。

與尾索動(dòng)物線粒體基因組相比, 在頭索動(dòng)物線粒體基因組中, 基因排列順序較為保守[17-18]。盡管2個(gè)類群(尾索動(dòng)物和頭索動(dòng)物)均為脊椎動(dòng)物的近親,但在線粒體基因組基因排列的特征上卻有如此顯著的差別, 說(shuō)明在2個(gè)類群之間, 線粒體基因組的進(jìn)化機(jī)制和選擇壓力可能會(huì)存在明顯差異, 在今后應(yīng)該得到進(jìn)一步的關(guān)注和探究。

圖1 尾索動(dòng)物線粒體主編碼基因的基因排列(不包含轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因)Fig. 1 Gene order of tunicates mitochondrial major coding genes (transfer RNA genes are excluded)

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因

在 3個(gè)物種(燈泡簇海鞘、薩氏海鞘和真海鞘)的線粒體基因組中存在atp8基因的缺失, 其余的 9個(gè)物種均包含后生動(dòng)物線粒體基因組標(biāo)準(zhǔn)的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。在樽海鞘線粒體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因中, 最為常用的起始密碼子為“TTG”; 而在11個(gè)海鞘綱物種的線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中,“ATG”出現(xiàn)的比例最高。除了這兩種起始密碼子外, 同時(shí)還存在“ATA”、“ATT”和“GTG”等3種起始密碼子。真海鞘線粒體基因組所有的蛋白質(zhì)編碼基因均以完全終止密碼子“TAA”或者“TAG”終止, 余下的 11個(gè)物種部分蛋白質(zhì)編碼基因中, 存在不完全的終止密碼子(“TA-”或者“T-”)(表2)。尾索動(dòng)物線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因所編碼的氨基酸數(shù)目并不保守。群體海鞘的cox2基因編碼313氨基酸, 比薩氏海鞘的cox2基因超出 92個(gè)氨基酸;而同時(shí), 玻璃海鞘的nad2基因編碼 369個(gè)氨基酸,與群體海鞘的nad2基因相比, 多了83個(gè)氨基酸(表2)。

2.4 選擇壓力

為了分析尾索動(dòng)物線粒體基因組蛋白編碼基因的選擇壓力, 統(tǒng)計(jì)了玻璃海鞘和薩氏海鞘蛋白質(zhì)編碼基因的同義替換率(Ks)和非同義替換率(Ka)。2個(gè)玻璃海鞘線粒體基因組 12個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/Ks比值都低于1(介于0.0927和0.6752之間), 顯示出一定的負(fù)(純化)選擇(圖 2)。其中,nad6基因的Ka/Ks比值最高(0.6752), 其次是nad3和nad2基因(分別為 0.4321和 0.3916), 因此表明, 在 13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中,nad6、nad3和nad2基因承受較小的選擇壓力和功能束縛。同時(shí),cox1基因的Ka/Ks比值最低(0.0927), 其次是nad1和cob基因(分別為0.1353和 0.1484), 從而說(shuō)明, 在尾索動(dòng)物線粒體基因組中,cox1、nad1和cob基因承受較強(qiáng)的選擇壓力和功能束縛。

表2 尾索動(dòng)物線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸數(shù)量及起始、終止密碼子Tab. 2 Amino acids number, initiation and termination codons in protein-coding genes of tunicates mitochondrial genomes

圖2 玻璃海鞘線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/Ks分析Fig. 2 The ratio of Nonsynonymous and synonymous substitutions rates (Ka/Ks)was estimated in protein-coding genes of Ciona mitochondrial genomes

2.5 基因變異位點(diǎn)特征

在種群遺傳學(xué)的研究中, 選擇合適的分子標(biāo)記至關(guān)重要。以12個(gè)尾索動(dòng)物、2個(gè)玻璃海鞘屬物種(玻璃海鞘和薩氏海鞘)和 2個(gè)次口海鞘屬物種(黑色次口海鞘和具疣次口海鞘)線粒體基因組作為數(shù)據(jù)群,分別進(jìn)行了基因變異位點(diǎn)分析。在尾索動(dòng)物線粒體基因組14個(gè)主編碼基因中,cox1基因最為保守, 變異位點(diǎn)的比例為61.57%。Cob、cox2-3、nad1和lrRNA等 5個(gè)基因變異位點(diǎn)的比例介于 70%～80%;atp6、nad3-5、srRNA和nad4L等6個(gè)基因變異位點(diǎn)的比例介于 80%～90%;nad2和nad6變異位點(diǎn)的比例超過(guò)90%(表3)。變異位點(diǎn)數(shù)最多的基因?yàn)閚ad5基因(1120個(gè)), 其次為nad4和cox1基因, 變異位點(diǎn)數(shù)分別達(dá)到1005和 931個(gè)。因此, 在尾索動(dòng)物種群遺傳的研究中,nad5和nad4基因可以作為備選的分子標(biāo)記。

表3 尾索動(dòng)物線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因和核糖體RNA基因的變異位點(diǎn)分析Tab. 3 Analysis of different loci of protein-coding genes and ribosomal RNA gene in tunicates mitochondrial genomes

在玻璃海鞘屬線粒體基因組的主編碼基因中,cox1和cox2基因最為保守, 變異位點(diǎn)的比例分別為16.21%和18.85%; 變異位點(diǎn)數(shù)最多的基因?yàn)閚ad5基因(462個(gè)), 其次為nad4基因(331個(gè))(表4)。與玻璃海鞘屬線粒體基因組類似, 在次口海鞘屬線粒體基因組主編碼基因中,cox2和cox1基因最為保守, 變異位點(diǎn)的比例分別為23.68%和23.97%; 變異位點(diǎn)數(shù)最多的基因?yàn)閚ad5基因(618個(gè)), 其次為nad4基因(527個(gè))(表5)。因此, 在玻璃海鞘和次口海鞘種群遺傳的研究中,nad5和nad4仍然可以作為備選的分子標(biāo)記。

表4 玻璃海鞘屬線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因和核糖體RNA基因的變異位點(diǎn)分析Tab. 4 Analysis of different loci of protein-coding genes and ribosomal RNA gene in Ciona mitochondrial genomes

表5 次口海鞘屬線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因和核糖體RNA基因的變異位點(diǎn)分析Tab. 5 Analysis of different loci of protein-coding genes and ribosomal RNA gene in Phallusia mitochondrial genomes

綜上所述, 在尾索動(dòng)物種群遺傳的研究中,nad5和nad4可以作為備選的分子標(biāo)記, 用于分析不同物種之間的遺傳多樣性, 為其生物多樣性的保護(hù)及合理利用其生物資源提供更多保障。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

目前在國(guó)際上, 基于線粒體基因組數(shù)據(jù)分析尾索動(dòng)物內(nèi)部的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系才剛剛興起[5,8], 對(duì) 12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組進(jìn)行全面的系統(tǒng)發(fā)育分析尚未見(jiàn)報(bào)道。作者基于12個(gè)線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列, 通過(guò)兩種方法(貝葉斯法和最大似然法)所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致(圖 3)。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果可以看出, 尾索動(dòng)物分為兩個(gè)分支: 海鞘綱和樽海鞘綱(BPP=100,BPM=100)。在海鞘綱內(nèi)部, 小海鞘、皺瘤海鞘、真海鞘和莫馬斯赫海鞘聚為一支, 從而支持褶鰓目為單系群(BPP=100, BPM=100)。具疣次口海鞘和黑色次口海鞘單獨(dú)聚為一支(BPP=100, BPM=100), 從而導(dǎo)致內(nèi)性目并非單系群。線粒體基因組的數(shù)據(jù)支持尾索動(dòng)物在科級(jí)的親緣關(guān)系為: (((柄海鞘科+芋海鞘科)+(((三段海鞘科+星骨海鞘科)+簇海鞘科)+玻璃海鞘科))+長(zhǎng)紋海鞘科)+海樽科(圖3)。

圖3 基于線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree based on aligned amino acids sequences from mitochondrial protein coding genes

3 結(jié)論

作者在12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組全序列的基礎(chǔ)上, 全面分析尾索動(dòng)物線粒體基因組的基本特征、基因排列、蛋白質(zhì)編碼基因、選擇壓力、變異位點(diǎn)和分子系統(tǒng)發(fā)育等。12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組的所有基因均在同一鏈上編碼, 這與脊椎動(dòng)物、頭索動(dòng)物線粒體基因組的基因分布特征顯著不同。尾索動(dòng)物線粒體基因組的基因組成與后生動(dòng)物線粒體基因組標(biāo)準(zhǔn)的基因組成并不完全一致, 存在轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因數(shù)目的增加, 同時(shí)在燈泡簇海鞘、薩氏海鞘和真海鞘的線粒體基因組中缺乏atp8基因。在12個(gè)尾索動(dòng)物線粒體基因組中, 發(fā)生了大規(guī)模的基因重排, 即使在同屬物種的線粒體基因組中, 也存在主編碼基因的基因重排和基因缺失。尾索動(dòng)物線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因使用的起始密碼子、終止密碼子及氨基酸長(zhǎng)度存在差異。2個(gè)玻璃海鞘線粒體基因組12個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的Ka/Ks比值都低于 1(介于0.0927和0.6752之間), 顯示出一定的負(fù)選擇。在尾索動(dòng)物群體遺傳的研究中,nad5和nad4可以作為備選的分子標(biāo)記, 用于分析不同物種和種群之間的生物多樣性?；诰€粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的氨基酸序列, 支持將尾索動(dòng)物分為兩個(gè)分支: 海鞘綱和樽海鞘綱。尾索動(dòng)物在科級(jí)的親緣關(guān)系為: (((柄海鞘科+芋海鞘科)+(((三段海鞘科+星骨海鞘科)+簇海鞘科)+玻璃海鞘科))+長(zhǎng)紋海鞘科)+海樽科。

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