2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立及其穩(wěn)定性評價

戴 冰，楊賽男，肖子曾*，何澤云，周芳亮，黃開顏，劉紅宇，邢 瑞

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410007)

腎陰虛證本質(zhì)的研究是中醫(yī)基礎研究的熱點和重點之一，中醫(yī)學認為糖尿病屬于“消渴”范疇，其重要病機特點為陰津虧損、燥熱偏盛，而以陰虛為本，燥熱為標。腎陰虛證是2型糖尿病的基本病理變化特點，約占糖尿病患者辨證的85%以上[1]。因此，對2型糖尿病腎陰虛證的研究對于中醫(yī)臨床治療2型糖尿病有著重要意義，而2型糖尿病腎陰虛證動物模型的建立是開展病證研究的首要任務。

然而國內(nèi)外對于2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的研究卻很少，沒有公認的造模方法及評價標準，對該模型的穩(wěn)定性的深入研究也甚少。僅見孫永寧[2]、馮雯[3]等采用皮下注射甲狀腺素聯(lián)合腹腔注射STZ，或腹腔注射四氧嘧啶聯(lián)合甲狀腺素灌胃建立糖尿病腎陰虛模型。但他們僅憑大鼠的血糖、外觀體征變化來判斷模型建立是否成功，血糖升高只能判斷動物為糖尿病模型，其是否是腎陰虛證的判斷標準卻很模糊，沒有具體的生化指標。

本實驗采用高脂乳喂養(yǎng)加小劑量STZ腹腔注射后灌服糖皮質(zhì)激素的方法研究2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立，并通過監(jiān)測模型大鼠不同時期空腹血糖值及血清cAMP水平來探討2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立成功與否，以及模型是否穩(wěn)定。旨在探索判斷2型糖尿病腎陰虛證動物模型成模的指標以及可行的造模方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康SD（Sprague-Dawley）大鼠,雄性、體質(zhì)量180～220 g，購自湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心（實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(湘)2009-2004）。適應性喂養(yǎng)1周，室溫20～24℃，相對濕度40%～70%。普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2 試劑 枸櫞酸（批號：100823）；磷酸氫二鈉（批號:101125）；鏈脲佐菌素(STZ，批號：S8050，純度98%）購自Sigma 公司；氫化可的松（批號：11021411，天津藥業(yè)焦作有限公司；胰島素（批號: 1102229，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；環(huán) 磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫試劑盒（批號: 20111206）。

1.1.3 儀器 快速血糖儀及血糖試紙：美國羅氏公司；冰箱：海爾集團；半自動生化分析儀：ca-958d型；旋渦混勻器：WH-1型，上海滬西分析儀器廠；電子天平：AG204型梅特勒-托利多；水浴鍋：北京長源實驗設備廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；臺式自動平衡離心機：TD4-Ⅱ型，長沙平凡儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂乳的制備 按比例配置新鮮高脂乳（30%丙二醇、20%吐溫-80、20%豬油、6%食鹽、5%膽固醇、5%果糖、5%蔗糖、1%谷氨酸鈉、1%丙硫氧嘧啶、蒸餾水適量）。稱取膽固醇5 g，蔗糖5 g，果糖5 g，丙硫氧嘧啶1 g，谷氨酸鈉1 g，食鹽6 g，量取20 mL吐溫-80，豬油20 mL，丙二醇30 mL，蒸餾水適量。將豬油置于水浴鍋中融化成液體狀，并將丙二醇加熱，待用。先將膽固醇、蔗糖、果糖研磨成細粉狀混合，加適量蒸餾水攪拌均勻后，加入已研碎的丙硫氧嘧啶，攪拌混勻，然后加入已加熱成液體狀的豬油混勻。將以上混合物與吐溫-80加入到已加熱的丙二醇中，邊加邊攪拌，待稍冷卻后加入谷氨酸鈉和食鹽，加入適量蒸餾水至100 mL，4℃保存。

1.2.2 動物分組 SD大鼠隨機分為2組：A組（普通飼料喂養(yǎng)組即對照組）6只，B組（高脂乳結(jié)合STZ及氫化可的松組即2型糖尿病腎陰虛證模型組）15只。

1.2.3 2型糖尿病大鼠模型的制備 參照文獻[4]及預實驗結(jié)果，模型組給予高脂乳喂養(yǎng)10 mL/（kg·d），空白對照組給予等量蒸餾水。持續(xù)10 d后，所有動物禁食不禁水12 h后，模型組大鼠腹腔注射STZ 40 mg/（kg·d），空白對照組腹腔注射等體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液。15 min后，給大鼠腹腔注射胰島素4 U，2.5 h時和5 h時灌胃給予25%葡萄糖10 mL/kg，64 h時開始禁食不禁水，72 h時檢測大鼠空腹血糖值?？崭寡侵怠?6.7 mmoL/L為方可繼續(xù)造模。

1.2.4 2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立 在2型糖尿病模型的基礎上，采用灌胃糖皮質(zhì)激素的方法制作腎陰虛模型[5]。2型糖尿病模型大鼠禁食12 h，按照35 mg/kg劑量灌服5 mg/mL/d氫化可的松，連續(xù)灌胃4 d，檢測大鼠空腹血糖值及血清cAMP，并以大鼠空腹血糖，值≥16.7 mmoL/L且血清cAMP上升者為2型糖尿病腎陰虛大鼠模型；繼續(xù)高脂乳喂養(yǎng)30 d后，再次檢測大鼠空腹血糖值及血清cAMP，對模型穩(wěn)定性進行評價 。

1.2.5 標本采集 大鼠禁食10 h，腹腔注射10%水合氯醛生理鹽水溶液0.35 g/kg麻醉，腹主動脈取全血，靜置，分離血清，-20℃凍存待檢。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病腎陰虛證大鼠體征變化

模型大鼠體質(zhì)量下降，精神不振，活動減少，反應較遲鈍，體毛無光澤、粗糙發(fā)黃暗淡，大便稍干結(jié)，色黑，肛門出現(xiàn)紅腫，飲水增加，進食量增加，尿量增加，尿黃，痛閾值降低等，與中醫(yī)腎陰虛證相吻合。

2.2 2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型血糖值變化

模型組與空白對照組比較，STZ注射72 h后模型組大鼠空腹血糖明顯高于空白對照組，比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）,大鼠空腹血糖值≥16.7 mmoL/L，2型糖尿病大鼠模型造模成功；造模成功30 天后模型組大鼠空腹血糖仍明顯高于空白組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示該模型穩(wěn)定性較好。結(jié)果見表1。

表1 兩組大鼠不同時期空腹血糖值比較（±s，mmoL/L）

表1 兩組大鼠不同時期空腹血糖值比較（±s，mmoL/L）

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n STZ注射72 h后血糖 灌胃氫化可的松后血糖 造模30 d后血糖空白組 6 6.00±0.50 6.00±0.48 6.08±0.35模型組 15 19.50±2.00** 19.40±2.05** 18.40±2.05**

2.3 2型糖尿病腎陰虛證大鼠血清cAMP的變化

與空白對照組比較，模型組大鼠成模時及成模30 d后血清cAMP水平明顯高于空白對照組，比較差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示該2型糖尿病模型是腎陰虛型，且腎陰虛持續(xù)、穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

表2 兩組大鼠不同時期血清cAMP值比較（mmoL/L）

3 討論

環(huán)核苷酸是調(diào)節(jié)細胞功能活動的重要物質(zhì)，cAMP是由ATP 經(jīng)腺苷酸環(huán)化酶及Mg+的作用生成的，能對細胞內(nèi)很多代謝過程產(chǎn)生影響[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)陽虛患者的血漿cAMP/cGMP比值降低；而陰虛患者則表現(xiàn)為cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高[7]。有研究表明，糖尿病患者的血漿cAMP及cAMP/cGMP比值均發(fā)生明顯變化[8]。由此可見，血清cAMP含量變化是2型糖尿病腎陰虛證辨證的重要指標。

本實驗結(jié)果顯示，2型糖尿病腎陰虛大鼠在表現(xiàn)出典型的糖尿病癥狀多飲、多食、多尿、體質(zhì)量下降，血糖值≥16.7 mmoL/L的同時，血清cAMP水平也明顯升高，在2型糖尿病腎陰虛證模型建立30 d后，其血糖值仍≥16.7 mmoL/L，血清cAMP仍明顯高于正常對照組，提示大鼠血清cAMP與糖尿病腎陰虛證密切相關,表明大鼠血清cAMP的變化可以作為2型糖尿病腎陰虛證模型成功與否及其穩(wěn)定性的判斷指標之一。

本實驗綜合借鑒2型糖尿病大鼠[9-10]及腎陰虛大鼠[11]兩種模型的造模方法，成功地建立了2型糖尿病腎陰虛大鼠模型，并且以血糖值≥16.7 mmoL/L且血清cAMP上升作為判斷模型成功與否的標準，對于2型糖尿病腎陰虛證動物模型的建立及評價有重要的意義。而血清cAMP值究竟要上升多少才可以判斷為糖尿病腎陰虛證，以及2型糖尿病腎陰虛證大鼠模型的建立還可以采用哪些指標作為評價指標都需要進一步實驗研究來確立。

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