大鼠前列腺炎模型中L6～S1背根神經節(jié)TRPV1和NGF的表達

陳 勇，張建華，趙 濤，孫 偉

（重慶市涪陵中心醫(yī)院泌尿外科 408000）

跨器官痛覺致敏是近年提出的關于內臟疼痛的一個新理論［1－2］，即一個病變內臟器官的疼痛繼發(fā)性引起另一個相鄰器官痛覺敏化，進而導致后者功能異常。研究發(fā)現，慢性前列腺炎疼痛呈現跨器官痛覺致敏的特點，推測前列腺疼痛產生機制可能與跨器官痛覺致敏有關，而背根神經節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經元瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid－1，TRPV1）的過度表達是跨器官痛覺致敏產生的主要原因［2－3］。本實驗通過制作大鼠前列腺炎模型［4］，觀 察 腰 骶 段 DRG TRPV1 和 神 經 生 長 因 子 （nerve growth factor，NGF）的表達，以了解DRG繼發(fā)性改變在慢性前列腺炎疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 完全氟氏佐劑（CFA）購自Sigma公司，抗TRPV1和抗NGF抗體購自武漢博士德公司，二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的分組與DRG標本制備 雄性成年SPF Wistar大鼠30只，體質量200g左右（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供），隨機分為實驗組和對照組，兩組分別設0、7、14d3個時相，共6組。實驗組在大鼠下腹正中做一長約1cm的小切口，顯露前列腺，前列腺內注射完全弗氏佐劑20μL，對照組注射等量生理鹽水，關閉切口。繼續(xù)飼養(yǎng)0、7、14d后分別用于實驗。將達到實驗天數的實驗組和對照組大鼠分別斷頭處死，解剖獲取L6～S1節(jié)段DRG，準確稱取濕質量。

1.2.2 逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）檢測 TRPV1、NGF mRNA表達 準確稱質量后，提取總RNA［參照Tripure說明書進行，所有使用器皿均經焦碳酸二乙酯（DEPC）或高溫干烤去RNA酶處理］，RT－PCR按試劑盒（上海Promega公司）說明書進行。選用β－actin作為內參照物。PCR引物序列：β－actin上游引物：5′－CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC－3′，下游引物：5′－TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC－3′，擴增片段長度150bp；TRPV1上游引物序列為5′－GCC CAA CGA AGA AAA CCA TAA－3′，下游引物序列為5′－ACA CGC TCA GCT CCC CAC－3′，擴增片段長度188bp；NGF上游引物序列5′－TGG CGG TCT TTT TTC GTT－3′，下游引物序列為 5′－GCA TTG CCT CCT TGA TTT GG－3′，擴增片段長度 114 bp。PCR反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退水1min，72℃延伸2min，共35個循環(huán)，72℃再延伸5min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One 4.4軟件分析各產物條帶光密度（OD）值，計算TRPV1、NGF mRNA的相對表達量。

1.2.3 蛋白質印跡檢測TRPV1、NGF蛋白表達 10%SDS和乙醇清洗SDS－PAGE電泳裝置，制備12%的分離膠和4%濃縮膠，取一定量的蛋白標本TRPV1 40μg和上樣緩沖液1∶1混合，準確上樣后進行SDS－PAGE電泳，濃縮膠80V，分離膠120V，取適當大小的凝膠和相同大小的PVDF膜在50V電壓下轉膜，觀察轉膜效果，PVDF膜置于5%去脂奶粉中封閉，依次加入一抗TRPV1（1∶400）、抗 NGF（1∶400），二抗（1∶1 000）雜交，室溫下振蕩封閉，化學發(fā)光顯色，用Quantity One4.4軟件分析圖像，采用積分吸光度值（IA）相對比較蛋白的表達。

2 結 果

2.1 TRPV1表達 大鼠L6～S1節(jié)段DRG中TRPV1的mRNA及蛋白表達量比較，實驗組7d與14d比較顯著高于對照組和實驗組0d（P＜0.01）；實驗組7d與14d比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1、2。

表1 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達TRPV1mRNA的變化（±s）

表1 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達TRPV1mRNA的變化（±s）

＊：P＜0.01，與對照組比較；▲：P＜0.01，與0d比較。

組別0d 7d 14d實驗組 0.411±0.021 0.789±0.065＊▲ 0.783±0.037＊▲對照組0.408±0.025 0.483±0.043 0.491±0.042

表2 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達TRPV1蛋白的變化±s，IOD）

表2 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達TRPV1蛋白的變化±s，IOD）

＊：P＜0.01，與對照組比較；▲：P＜0.01，與0d比較。

組別0d 7d 14d實驗組 10.23±1.42 20.05±1.86＊▲ 19.48±1.95＊▲對照組10.38±1.11 13.17±1.63 12.34±1.42

2.2 NGF表達 大鼠L6～S1節(jié)段DRG中NGF的蛋白及mRNA表達量比較，實驗組7d和14d顯著高于對照組和實驗組0d（P＜0.01）；實驗組14d低于實驗組7d（P＜0.05），見表3、4。

表3 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達NGF mRNA的變化（±s）

表3 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達NGF mRNA的變化（±s）

＊：P＜0.01，與對照組比較；▲：P＜0.01，與0d比較；◆：P＜0.05，與7d比較。

組別0d 7d 14d實驗組 0.431±0.032 0.719±0.046＊▲ 0.582±0.019＊▲◆對照組0.427±0.025 0.438±0.068 0.489±0.054

表4 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達NGF蛋白的變化（±s，IOD）

表4 各組大鼠L6～S1DRG神經元表達NGF蛋白的變化（±s，IOD）

＊：P＜0.01，與對照組比較；▲：P＜0.01，與0d比較；◆：P＜0.05，與7d比較。

組別0d 7d 14d實驗組 9.77±1.20 19.85±1.51＊▲ 15.47±2.18＊▲◆對照組9.87±1.10 12.46±1.29 12.12±1.13

3 討 論

慢性前列腺炎病因尚不十分清楚，治療較為棘手，疼痛為其主要表現，也是患者就診的主要原因［5］。前列腺疼痛不只局限于前列腺部位，而是分布在整個腰骶神經支配區(qū)，在沒有原發(fā)病變的其他部位也可能出現自發(fā)疼痛；而且臨床上有些前列腺疼痛在前列腺炎癥消失后疼痛仍然存在。目前對疼痛產生的機制尚不清楚。

跨器官痛覺致敏是近年提出的關于內臟疼痛的一個新理論［1，3］，即一個病變內臟器官的疼痛繼發(fā)引起另一個相鄰器官痛覺敏化，進而導致后者功能異常。脊髓前、脊髓、脊髓上（大腦）的3段不同但相互關聯的神經通路構成盆腔跨器官痛覺致敏的解剖基礎［1，6］；這3段通路共同對盆腔器官的跨器官痛覺致敏起作用。目前認為脊髓前（背根神經節(jié)）起主要作用，同時對其研究較多［1－3］，通常認為跨器官痛覺致敏外周通路的解剖基礎是DRG神經元通過分支軸突聯結到不同盆腔結構。

跨器官痛覺致敏理論的提出為闡明CP／CPPS疼痛的發(fā)生機制提供了一條嶄新思路［3］。慢性前列腺炎疼痛具備跨器官痛覺致敏的特點，而且作者前期研究發(fā)現腰骶段DRG神經元有分支同時投射到前列腺與盆底、會陰部［7］，也即前列腺與盆腔器官存在跨器官痛覺致敏產生的解剖學基礎。因此，作者認為慢性前列腺炎疼痛產生與跨器官痛覺致敏密切相關，具體信號傳導通路需進一步研究。

TRPV1廣泛分布于初級感覺神經元末梢的傷害性感受器上，現已證明其參與炎癥和痛覺過敏的形成［2，6］。TRPV1是一種非選擇性陽離子通道，參與初級感覺神經元外周末端中傷害性刺激分子整合，可探測和整合誘發(fā)痛覺的化學和熱刺激信號，主要有辣椒素（紅辣椒的辛辣成分）、傷害性熱（＞43℃）及質子等。TRPV1的活性可以通過NGF、緩激肽等刺激來啟動細胞內瀑布信號轉導，以這種方式，NGF、緩激肽就能降低TRPV1閾值，以至在正常的情況下允許通道開放，從而誘導痛覺過敏［8］。TRPV1主要分布于背根神經節(jié)和三叉神經節(jié)，在前列腺與膀胱主要分布在上皮細胞和上皮下的初級感覺傳入纖維漿膜表面［9］，其主要生理功能是參與排尿反射，病理情況下與膀胱炎性痛、痛覺過敏以及膀胱刺激癥有關。Miller等［10］報道慢性前列腺炎患者前列腺液的NGF濃度與患者的NIH－CPSI的疼痛評分成正相關，而NGF是一種炎癥痛覺過敏的關鍵因子［11］。因此，作者推測NGF與TRPV1在慢性前列腺炎疼痛起重要作用。

CFA常用于制作疼痛模型，其原理是以結核桿菌等復合物作為抗原的遲發(fā)性過敏反應或自身免疫性疾病，急性期主要為炎癥性痛，慢性期主要為神經源性痛［4］。本實驗通過大鼠前列腺注射CFA制作慢性前列腺炎疼痛模型，發(fā)現腰骶段DRG神經元NGF的表達在7d達到高峰，14d時表達有所下降；而TRPV1在7d和14d呈現持續(xù)高表達。作者前期工作發(fā)現，前列腺注射CFA，前列腺炎癥反應在7d時較為明顯，但在14 d時炎癥反應明顯減輕［12］，從而說明NGF表達隨前列腺炎癥消退而降低，但TRPV1表達并不隨前列腺炎癥的消退而降低，TRPV1持續(xù)的高表達與慢性前列腺炎疼痛的維持與泛化密切相關。Amaya等［8］發(fā)現炎癥反應時，DRG的NGF表達增加可以引起TRPV1表達增加，并進一步引起痛覺過敏。因此推測，慢性前列腺炎患者的前列腺液NGF濃度增加［10］，激活初級感覺神經元外周末端Aδ和C纖維，信息上傳至DRG，上調DRG神經元TRPV1表達，開放離子通道，通過DRG會聚神經元軸突反射引起跨器官痛覺致敏，但NGF和TRPV1在DRG的信號傳遞通路尚需進一步研究。

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