羧化單壁碳納米管/二茂鐵/離子液體復(fù)合電極對(duì)葉酸的電催化研究

馬建國(guó)， 謝冬香， 毛燕妮， 張麟熹， 朱朝俞

(1.東華理工大學(xué)放射性地質(zhì)與勘探技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，江西 撫州 344000;2.核資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 撫州 344000)

葉酸是由喋啶，對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸殘基組成的一種水溶性B族維生素，亦稱為維生素BC或維生素M。其為機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖所必需的物質(zhì)，有助于蛋白質(zhì)的代謝，并能與維生素B12共同作用促進(jìn)紅細(xì)胞的生成和成熟，是制造紅血球不可缺少的物質(zhì)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，孕婦經(jīng)常補(bǔ)充葉酸，可防止新生兒體重過(guò)輕、早產(chǎn)以及嬰兒腭裂(兔唇)等先天性畸形(劉志誠(chéng)等，1993)。目前測(cè)定葉酸的方法主要有熒光分光光度法(安會(huì)梅等，2007)、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法(蔡卓等，2009)等，但電化學(xué)法測(cè)定葉酸鮮有報(bào)道(Kalimuthu et al.，2009)。

離子液體是指由有機(jī)陽(yáng)離子和陰離子構(gòu)成的在室溫下呈液態(tài)的鹽類化合物。它具有常規(guī)溶液所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)，如蒸氣壓極小、不揮發(fā)、不可燃、毒性小，能夠溶解多種有機(jī)物無(wú)機(jī)物和聚合物，導(dǎo)電性好，具有較寬的電化學(xué)窗口等，而且它還可以通過(guò)改變組成比例調(diào)節(jié)自身的酸性和其它物理化學(xué)性質(zhì)(Dhanusuraman et al.，2009;鄧友全，2006;Chiappe et al.，2005)。這一系列特點(diǎn)對(duì)于其用于構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器具有良好的前景。

單壁碳納米管(SWCNTs)可促進(jìn)某些電活性物質(zhì)和電極間的電子轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)某些反應(yīng)的電催化活性，但由于單壁碳納米管在水溶液中的分散性差，使其應(yīng)用受到限制。為了改善單壁碳納米管的分散性，可通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法對(duì)其進(jìn)行改性。而羧基由于親水性較好，在碳管表面接枝羧基既可以增加碳納米管的溶解性和分散性，而且羧基作為吸電子基團(tuán)，有助于增強(qiáng)碳納米管的導(dǎo)電能力(Wang et al.，2005;張剛等，2001)。目前，針對(duì)改性碳納米管和二茂鐵(Fc)復(fù)合修飾電極的研究較為少見。

本文結(jié)合離子液體、碳納米管和二茂鐵各自的特點(diǎn)，利用合成的羧化單壁碳納米管，離子液體和二茂鐵的復(fù)合產(chǎn)物對(duì)玻碳電極進(jìn)行改性，以制備離子液體-羧化單壁碳納米管-二茂鐵復(fù)合膜修飾電極，通過(guò)循環(huán)伏安法研究該修飾電極在不同條件下對(duì)葉酸的電催化作用，為其檢測(cè)建立一種新型的測(cè)定方法和技術(shù)，并為其它生物分子的測(cè)定與表征開辟一條新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極體系:玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑片電極為輔助電極;UV-2550PC型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，在室溫下以三氯甲烷作為溶劑進(jìn)行測(cè)試;5700型傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司)，儀器主要指標(biāo):光譜范圍 7 800～350 cm－1，分辨率為0.09 cm－1，快速掃描 65次/s，在 KBr壓片上制樣，測(cè)定透射光譜。

葉酸(上?；瘜W(xué)試劑一廠)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:將0.022 1 g葉酸溶于50 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液(PBS)中，配成1.00 ×10－4mol/L 的儲(chǔ)備液(5℃冷藏，待用);二茂鐵(廣東西隴化工廠);單壁碳納米管(中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所)使用前按Chiang等(2001)進(jìn)行純化;離子液體按照Paulo等(1996)制備;PBS溶液由磷酸二氫鉀溶液(0.1 mol/L)與磷酸氫二鉀溶液(0.1 mol/L)配制而成，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)SWCNTs的羧化(D＇Este et al.，2006)。將500 mg純化后的 SWCNTs置于250 mL的濃H2SO4/70%HNO3=3/1混合溶液中，在室溫下超聲1 min，然后加入濃鹽酸，繼續(xù)超聲15 min，得到羧化的單壁碳納米管。將產(chǎn)物依次用氫氧化鈉溶液和大量的去離子水洗至中性，用0.2 μm的濾膜過(guò)濾收集固體產(chǎn)物，并將產(chǎn)物在70℃下真空干燥24 h。

(2)修飾電極的制備。將玻碳電極依次用金相砂紙和顆粒直徑為50 nm的Al2O3粉末打磨、拋光。然后再分別用1 mol/L硝酸、蒸餾水、無(wú)水乙醇超聲清洗各15 min。再用蒸餾水沖洗干凈，室溫下自然晾干，備用。

取[BMIm]PF6離子液體5 mL置于25 mL燒杯里，加入適量的二茂鐵和羧化單壁碳納米管5 mg，攪拌均勻后超聲，使溶液成均一的懸濁液，用10 μL微量進(jìn)樣器取該混合溶液滴涂于處理后的玻碳電極表面，再置于紅外燈下烘干，待用。

(3)葉酸的測(cè)定。通過(guò)試驗(yàn)獲得修飾電極的最佳實(shí)驗(yàn)條件后，分別取30 mL不同濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于50 mL燒杯中，緩慢通入氮?dú)猓缓笠孕揎楇姌O為工作電極，將CHI660D電化學(xué)工作站中的三電極體系置于燒杯中，靜置溶液體系，在－0.2～1.0 V電位范圍內(nèi)測(cè)定葉酸的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧化碳納米管的表征

由于本實(shí)驗(yàn)中的單壁碳納米管在羧化過(guò)程中要盡量保持碳管的導(dǎo)電性能不被破壞，所以在超聲處理時(shí)控制時(shí)間約為1 h。羧化后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)紅外譜圖和紫外-可見光譜圖表征，結(jié)果見圖1所示。由圖1(A)紅外譜圖可以看出，與純化SWCNTs(a)相比，羧化后的單壁碳納米管在波數(shù)為2 916 cm－1的位置有一個(gè)較為明顯的—COOH伸縮振動(dòng)峰。而在波數(shù)為1 760 cm－1的位置處則有一個(gè)不太明顯的C＝O伸縮振動(dòng)峰，這可能是因?yàn)轸然某潭炔桓邔?dǎo)致的。紫外-可見光吸收光譜表征可以說(shuō)明碳管修飾前后的表面變化。變化的量度主要是通過(guò)范霍夫規(guī)整度進(jìn)行比較。因?yàn)樾揎椙暗膯伪谔技{米管的表面的大量物質(zhì)結(jié)構(gòu)都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的吸收光譜峰，被稱之為范霍夫奇點(diǎn)。碳管修飾后，將導(dǎo)致表面大量范霍夫奇點(diǎn)消失，即紫外吸收峰減少(Bahr et al.，2002)。這種表面結(jié)構(gòu)上的變化表明碳管表面的π鍵體系因發(fā)生了共價(jià)鍵改性而被破壞，從而減少了范霍夫奇點(diǎn)。圖1(B)的紫外－可見光吸收譜圖顯示羧化前后的單壁碳納米管的吸收曲線發(fā)生明顯變化。其中羧化前的碳納米管的紫外吸收曲線在370，480，550，650 nm 左右均出現(xiàn)了明顯的寬吸收峰，而羧化后的碳管在這些位置的吸收峰均消失了，吸收曲線在300～800 nm之間變的較為平滑。通過(guò)以上表征結(jié)果說(shuō)明SWCNTs的羧化是成功的。

2.2 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 緩沖溶液的選擇

圖1 純化單壁碳納米管和羧化單壁碳納米管的紅外譜圖(A)和紫外－可見光譜圖(B)Fig.1 The IR(A)and UV-vis(B)spectrum of the purified SWCNTs and carboxylic SWCNTs

考察了5.0×10－5mol/L葉酸在不同的緩沖溶液Na2HPO4-C6H8O7·H2O，NaH2PO4-NaOH，C6H8O7·H2O-Na3C6H5O7·2H2O和PBS中[BMIM]PF6/SWCNTs—COOH/Fc修飾電極的電化學(xué)行為。結(jié)果表明，葉酸在上述這幾種溶液中都出現(xiàn)氧化還原峰，其中在PBS緩沖溶液中的峰形最好，氧化還原電流最大。同時(shí)，在pH值范圍3.0～8.0內(nèi)的PBS溶液中，對(duì)濃度為5.0×10－5mol/L的葉酸溶液進(jìn)行循環(huán)掃描，發(fā)現(xiàn)氧化還原峰電流隨pH值增加而增大，當(dāng)pH=6.8時(shí)達(dá)到最大，隨后其值又隨著pH值的增加而降低。所以實(shí)驗(yàn)選擇在pH=6.8的PBS緩沖溶液中檢測(cè)葉酸。

2.2.2 掃速的選擇

掃描速率反映了電極表面的電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理。圖2是在5.0×10－5mol/L葉酸溶液中，掃描速率在0.05 ～0.4 V/s范圍內(nèi)，[BMIm]PF6/SWCNTs—COOH/Fc修飾電極的循環(huán)伏安曲線。由圖可知，隨著掃速的增大，ipa與ipc均變大，峰電位差ΔEp也隨之增大。這是因?yàn)閽呙杷俾试礁?，峰所?duì)應(yīng)的電化學(xué)反應(yīng)速率越高，峰電流也越大。實(shí)驗(yàn)證明，在0.05～0.4 V/s掃速范圍內(nèi)，電極的氧化峰電流與掃速平方根成良好的線性關(guān)系(圖2)，線性關(guān)系式為:ipa= －27.828 ×10－5VI/2+1.074 2 ×10－5，其中相關(guān)系數(shù)R=0.997 8。這說(shuō)明葉酸在該修飾電極上的電化學(xué)反應(yīng)是受擴(kuò)散電流控制的(董紹俊等，2003)。而且由圖2可以看出，峰電流隨掃速增大而增大，但是為避免掃速過(guò)高帶來(lái)的充電電流過(guò)大對(duì)測(cè)定造成影響，降低信噪比。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇掃速0.15 V/s為宜。

2.3 不同修飾電極的電催化能力比較

圖2 不同掃描速率的葉酸循環(huán)伏安法曲線(A)和氧化峰電流與掃速平方根關(guān)系圖(B)Fig.2 Cyclic voltammograms of FA at modified electrode with different scan rates(A)and relationship between oxidation peak current and scan rate(B)

用循環(huán)伏安測(cè)定在前面討論得到的最佳實(shí)驗(yàn)條件下研究了不同組分的修飾電極對(duì)葉酸氧化峰電流的影響，如圖3所示。結(jié)果顯示在pH=6.8的PBS 中，當(dāng)掃描速率為0.15 V/s時(shí)，5.0 ×10－5mol/L葉酸不同電極上的循環(huán)伏安圖存在較大差異。其中葉酸在[BMIm]PF6/SWCNTs—COOH/Fc復(fù)合膜修飾電極作用下，峰電流增大最為顯著。這是因?yàn)轸然H水性好，用它改性單壁碳納米管可以增加碳納米管的親水性，使碳納米管分散性更好，而且羧基是吸電子基，所以羧基改性碳納米管的導(dǎo)電能力增強(qiáng)。這些都說(shuō)明了復(fù)合膜修飾后的玻碳電極能夠促進(jìn)葉酸在電極表面的電子傳遞速率，對(duì)葉酸具有很好的電催化作用。

2.4 樣品濃度對(duì)測(cè)試的影響及電極穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為比較不同濃度葉酸中修飾電極的電化學(xué)行為，試驗(yàn)了[BMIm]PF6/SWCNTs—COOH/Fc修飾電極在濃度分別為5 ×10－8，1 ×10－7，1 ×10－6，1 ×10－5，2 ×10－5，6 ×10－5，1 ×10－4mol/L 的葉酸溶液中的循環(huán)伏安曲線，研究結(jié)果見圖4。由圖可知，氧化峰電流ipa、ipc隨著葉酸的濃度降低而降低，當(dāng)葉酸濃度達(dá)到5×10－8mol/L時(shí)，幾乎沒有氧化還原峰出現(xiàn)。葉酸氧化峰電流與其濃度在0.1～60 μmol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為:ipa=－1.3965C －1.6172，相關(guān)系數(shù) R=0.9962，且葉酸在修飾電極上的檢出限為8.6×10－8mol/L。

另外，在5.0×10－5mol/L葉酸溶液中，我們用同一支電極連續(xù)測(cè)定10次，對(duì)葉酸的電流響應(yīng)變化很小。將電極在空氣中放置10 d后，對(duì)葉酸的電流響應(yīng)減小9.6%，表明該修飾電極具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

在pH=6.8的PBS緩沖溶液中，固定葉酸的濃度為5.0×10－5mol/L，考察一些常見的物質(zhì)對(duì)葉酸的電化學(xué)檢測(cè)的干擾情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)葉酸的濃度為5.0×10－5mol/L時(shí)，與之共存的一些常見無(wú)機(jī)離子(如Na+，NH4+，Zn2+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Cl－，SO42－)以及相同濃度的 VB2，VB12葡萄糖、檸檬酸、蔗糖等有機(jī)物均不干擾測(cè)定。

2.6 樣品回收實(shí)驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，本實(shí)驗(yàn)取實(shí)際葉酸片劑作為測(cè)試樣品(每片的葉酸含量為5 mg)，經(jīng)研缽粉碎后，按照不同比例溶解在PBS中，并在250 mL容量瓶中稀釋、定容、搖勻。分別得到系列濃度的葉酸樣品溶液。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用加標(biāo)回收法通過(guò)[BMIm]PF6/SWCNTs—COOH/Fc膜修飾電極測(cè)定葉酸的回收率，得到回收率為97.47% ～101.26%，實(shí)驗(yàn)效果較好，具體結(jié)果見表1。

表1 葉酸加標(biāo)回收率Table1 Recovery of FA in standard solution(10－7mol/L)

3 結(jié)論

本文采用滴涂法制備的[BMIm]PF6/SWCNTs—COOH/Fc復(fù)合膜修飾電極在 pH=6.8的PBS緩沖溶液中，0.15 V/s的掃描速率下的電化學(xué)行為是受擴(kuò)散控制的氧化-還原過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證明它對(duì)葉酸具有很好的電催化氧化作用，并且靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、檢出限較低，可以用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。該方法也為新型生物化學(xué)傳感器的研制奠定了基礎(chǔ)。

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