反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定西紅花苷I和西紅花酸

梁華正， 袁東香， 丁武輝，2， 劉成佐， 廖曉峰

(1.東華理工大學(xué)生物系，江西 撫州 344000;2.臨川之信生物科技有限公司，江西 撫州 344000)

西紅花苷(crocin)和西紅花酸(crocetin)是中藥梔子和西紅花的重要成份以及藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。西紅花酸是西紅花苷的苷元，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，西紅花酸可以由堿水解西紅花苷而制得。西紅花苷是西紅花酸與不同糖基結(jié)合而成的糖酯，主要有西紅花苷I和西紅花苷II。西紅花苷可以在動(dòng)物腸道內(nèi)被水解生成西紅花酸，然后被吸收進(jìn)入血液循環(huán)(Asai et al.，2005;陳陽等，2010)。西紅花苷和西紅花酸具有廣泛的藥理活性，如抑制腫瘤細(xì)胞(Tseng et al.，1995;Chryssanthi et a1.，2007;Magesh et a1.，2006)，抗氧化(陳陽等，2010;方志凱等，2007;Gong et a1.，2001)，心肌損傷修復(fù)(Zhang et al.，2009;韓瀟媛等，2009)，改善睡眠(Kuratsune et al.，2010)等，具有較好的應(yīng)用前景。

西紅花苷的測(cè)定方法主要有分光光度法、薄層掃描法和高效液相色譜法(李順旭等，2010;何常明等，2006)，其中高效液相色譜法為2010版中國藥典采用的方法。西紅花酸的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(劉同征等，2002)和高效液相色譜法質(zhì)譜聯(lián)用法(Park et al.，2001)。本文建立了反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定西紅花苷I和西紅花酸的方法，對(duì)西紅花酸生產(chǎn)過程的控制有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖1 西紅花酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of crocetin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試藥與材料

LC-20AT/SPD-10A高相液相色譜儀(日本島津);N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司);C8 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，大連依利特);TU-1810PC紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

西紅花苷I對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所);西紅花酸對(duì)照品(Carotenature公司，瑞士);甲醇(色譜純，上海陸都化學(xué)試劑廠);其他試劑均為分析純。

梔子黃色素(臨川之信生物科技有限公司);所用水為蒸餾水;高效液相色譜用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)流動(dòng)相的配制。流動(dòng)相為甲醇水冰醋酸溶液，甲醇、水和冰醋酸比例為 75∶24.5∶0.5。

(2)含西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品溶液的配制。精密稱取西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品各1.0 mg，定量轉(zhuǎn)移置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成含西紅花苷I和西紅花酸為0.1 mg·mL－1的溶液，即為西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品溶液。

(3)含西紅花苷I和西紅花酸供試品溶液的制備。精密稱取梔子黃色素1.0 g，用少量水溶解于250 mL燒杯中，加入氫氧化鈉0.2 g，充分混勻后，加水使終體積為100 mL，置于60℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行水解30 min，并充氮?dú)獗Ｗo(hù)。取水解液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成含西紅花苷I和西紅花酸的供試品溶液。

(4)含西紅花苷I和西紅花酸樣品溶液的制備。精密稱取梔子黃色素1.0 g，用少量水溶解于250 mL燒杯中，加入氫氧化鈉0.2 g，充分混勻后，加水使終體積為100 mL，置于60℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行水解反應(yīng)，并充氮?dú)獗Ｗo(hù)。分別取水解10，20，30，40，50，60 min 的水解液各1.0 mL，置于 100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成含西紅花苷I和西紅花酸不同濃度的樣品溶液。

(5)色譜條件。色譜柱為大連依利特C8柱(4.6 mm ×250 mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇水冰醋酸溶液，比例甲醇∶水∶冰醋酸為75∶24.5∶0.5;流速為0.6 mL·min－1，檢測(cè)波長為 440 nm，進(jìn)樣量為 10 μL，柱溫為室溫。

(6)西紅花酸水解產(chǎn)率的計(jì)算。梔子黃色素水解轉(zhuǎn)化為西紅花酸的產(chǎn)率可用下式計(jì)算:

式中T為梔子黃色素轉(zhuǎn)化為西紅花酸的產(chǎn)率;C為西紅花酸在水解液中的含量(μg·mL－1)，V為水解液的體積(mL);M為水解前梔子黃色素的初始量(μg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長的確定

分別取西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品溶液，將西紅花苷I對(duì)照品溶液用蒸餾水稀釋20倍，西紅花酸對(duì)照品溶液用蒸餾水稀釋50倍，然后分別進(jìn)行220～760 nm范圍內(nèi)紫外可見光譜掃描(圖2)。由圖2可知，西紅花苷I在339，440，472 nm處有吸收峰值，且440 nm處的吸收值最大，西紅花酸在在430 nm和440 nm有吸收峰，因此確定440 nm作為HPLC法同時(shí)測(cè)定西紅花苷I和西紅花酸的檢測(cè)波長。

圖2 西紅花苷I(a)和西紅花酸(b)對(duì)照品紫外可見光譜掃描曲線Fig.2 The UV-Visible spectral scanning curve of crocin I(a)and crocetin(b)

2.2 西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品色譜圖

按上述方法配制含西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品溶液，取該對(duì)照品溶液1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，然后進(jìn)行檢測(cè)，得到色譜圖如圖3所示。

圖3 西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品色譜圖Fig.3 The chromatogram of crocin I and crocetin reference substance

由圖3結(jié)合西紅花苷I和西紅花酸單獨(dú)進(jìn)樣的色譜圖可知，圖中的2個(gè)峰分別為西紅花苷I，其保留時(shí)間為1.778 min，另一個(gè)峰位西紅花酸，其保留時(shí)間為19.650 min，而采用C18柱進(jìn)行試驗(yàn)，西紅花酸的保留時(shí)間要延長(Park et al.，2001)。相同質(zhì)量百分比濃度下西紅花苷I峰高大于西紅花酸的峰高，但是西紅花酸的峰面積大于西紅花苷I的峰面積，原因在于西紅花苷I的極性強(qiáng)于西紅花酸，當(dāng)流動(dòng)相甲醇水冰醋酸比例為 75∶24.5∶0.5時(shí)，西紅花苷I很快出峰，并且峰型尖銳，而西紅花酸與固定相結(jié)合力較強(qiáng)，保留時(shí)間長于西紅花苷I，流動(dòng)相的洗脫峰峰型寬。

2.3 線性關(guān)系分析

配制好含西紅花苷I和西紅花酸對(duì)照品溶液后，精密移取上述溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，繼續(xù)用流動(dòng)相稀釋得到含西紅花苷 I和西紅花酸為 0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0 μg·mL－1的溶液，分別按色譜條件測(cè)定西紅花苷I和西紅花酸的峰面積，以西紅花苷I和西紅花酸的濃度(μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，西紅花苷I和西紅花酸的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。西紅花苷I的回歸方程為Y=67 332X－9 312，R2=0.999 7，西紅花酸的回歸方程為Y=117 426 X+16 140，R2=0.999 3。結(jié)果表明，西紅花苷I和西紅花酸濃度為 0.625 ～40.0 μg·mL－1，進(jìn)樣量為10 μL時(shí)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系(圖4)。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

先制備含西紅花苷I和西紅花酸的供試品溶液，取該供試品溶液 10 μL，分別在 0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣，測(cè)定西紅花苷I和西紅花酸的峰面積，結(jié)果西紅花苷I峰面積RSD為2.30%，西紅花酸峰面積RSD為2.22%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取含西紅花苷I和西紅花酸的供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，西紅花苷I和西紅花酸峰面積積分值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.33%和1.42%，表明本方法精密度良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

圖4 西紅花苷I(a)和西紅花酸(b)峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of peak area of crocin I(a)and crocetin(b)

精密量取含西紅花苷I和西紅花酸的供試品溶液2.0 mL 6份，分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中，然后分別加入含西紅花苷I和西紅花酸的對(duì)照品溶液1.0 mL，加水至刻度，搖勻，精密吸取10 μL 按上述色譜條件測(cè)定，平均回收率為101.33%，RSD=0.60%。

2.7 樣品的測(cè)定

按上述方法配制含西紅花苷I和西紅花酸的樣品溶液，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算峰面積后用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算西紅花酸的含量(表1)。

表1 含西紅花苷I和西紅花酸的樣品溶液測(cè)定結(jié)果Tab.1 Sample solution with crocin I and crocetin

由表1結(jié)果可知，未水解樣品溶液中西紅花苷I的含量為 62.33 μg·mL－1，考慮到樣品制備時(shí)梔子黃色素被稀釋了10 000倍，可以計(jì)算出該批梔子黃色素中西紅花苷I的含量為62.33%。對(duì)該批梔子黃色素進(jìn)行HPLC測(cè)定，其色譜圖如圖5所示。對(duì)比對(duì)照品可知，保留時(shí)間為1.740 min的峰為西紅花苷I，另外2個(gè)峰未知，可能是其他西紅花苷類物質(zhì)。

圖5 梔子黃色素HPLC譜圖Fig.5 The chromatogram of gardenia yellow pigment

由于梔子黃色素中除了含有西紅花苷I外，還有西紅花苷II、西紅花苷III和西紅花苷IV，因此單純用西紅花苷I的含量計(jì)算水解反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率會(huì)出現(xiàn)大于100%的情況，而按梔子黃色素用量計(jì)算水解反應(yīng)生成西紅花酸的產(chǎn)率為28.76%。

3 結(jié)論

建立了HPLC同時(shí)測(cè)定西紅花苷I和西紅花酸的方法，對(duì)用氫氧化鈉水解不同時(shí)間的梔子黃色素樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果可以反映堿對(duì)梔子黃色素中西紅花苷I的水解過程。采用C8色譜柱代替C18柱，縮短西紅花酸的保留時(shí)間，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。流動(dòng)相采用甲醇水冰醋酸溶液，比例為 75∶24.5∶0.5，西紅花苷I和西紅花酸得到較好的分離，西紅花苷I和西紅花酸濃度在 0.625 ～ 40 μg·mL－1范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。該方法重復(fù)性好、準(zhǔn)確、快速，對(duì)西紅花酸生產(chǎn)過程的控制有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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