骨質(zhì)疏松癥脾腎兩虛型病證結(jié)合動物模型的建立*

劉梅潔，李鴻泓，王少君，劉 紅，于 崢，潘靜華，趙宏艷，李 艷，付小衛(wèi)，宋長恒，鞠大宏

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

中醫(yī)理論認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，腎虛是其根本原因，脾虛是主要因素之一，“脾腎相關(guān)”，兩臟俱虛，可共同導(dǎo)致該病的發(fā)生。本研究以此為理論基礎(chǔ)，開展了骨質(zhì)疏松癥脾腎兩虛型病證結(jié)合動物模型的建立工作，并深入探討機(jī)體在腎虛、脾虛和脾腎兩虛狀態(tài)下，骨量、骨吸收和骨形成的變化情況及存在的差異。

1 材料與方法

1.1 動物

選用健康雌性 SPF級 Wistar大鼠 72只，體重200g～220g，由中國藥品生物制品檢定所提供(許可證號SCXK(京)2009-0017)，在中日友好醫(yī)院臨床研究所動物室屏障系統(tǒng)(實驗動物室許可證號SYXK(京)2010-0011)。

1.2 藥物

己烯雌酚由合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)(批號20100120，每片1 mg)，使用時用蒸餾水制成濃度為0.0046 mg/mL的混懸液，給藥體積為1 mL/100g體重，給藥劑量為0.046 mg/kg體重。大黃濃煎液為川大黃水煎制，濃縮至200%。

1.3 試劑

戊巴比妥鈉由美國 Sigma公司生產(chǎn)(批號20090305);鹽酸四環(huán)素由美國 Amresco公司生產(chǎn)(批號20090301);甲基丙烯酸甲酯由北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)(批號20050317);甲基丙烯酸丁酯由北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)(批號980716);聚乙二醇400由北京化學(xué)試劑公司生產(chǎn)(批號050425);苯甲酸甲酯有華北地區(qū)特種化學(xué)試劑開發(fā)中心(天津)生產(chǎn)(批號980923);過氧化苯甲酰由北京金龍化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)(批號20000420);N，N－二甲基對甲苯胺(N，N-Dimethylp-toluidine)由ALDRICH公司生產(chǎn)(批號04327MB-235)。Ⅰ液:100ml甲基丙烯酸甲酯+35ml甲基丙烯酸丁酯+5ml苯甲酸甲酯+1.2ml聚乙二醇400;Ⅱ液:Ⅰ液+0.4g干燥過氧化苯甲酰;Ⅲ液:Ⅱ液 +0.8g干燥過氧化苯甲酰。

1.4 儀器

冷凍切片機(jī):英國 TBS公司;Reicheit-Jung2040切片機(jī):德國;LEICA CTR6000顯微鏡:德國 Leica公司;Leica-Qwin圖像分析儀系統(tǒng):德國 Leica公司。

1.5 方法

1.5.1 動物分組、模型制作及處理 選用健康雌性Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為3組，其中正常對照組12只，假手術(shù)組12只，脾虛模型組12只，卵巢切除組36只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將卵巢切除組大鼠以45mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹位固定，行卵巢切除術(shù)［1］。假手術(shù)組只是切除小塊脂肪組織，但不摘除卵巢。術(shù)后10周，將卵巢切除組大鼠隨機(jī)分為腎虛模型組、脾腎兩虛模型組及陽性對照組。脾虛模型組及脾腎兩虛模型組大鼠用200%的大黃濃煎液灌胃，4ml/只，每日1次，連續(xù)14 d;同時其余各組大鼠胃飼等容積的蒸餾水。隨后，陽性對照組大鼠灌胃給予己烯雌酚，每日1次，連續(xù)6d，休息1d，再連續(xù)給藥6d，每周稱重 1次，據(jù)此調(diào)整給藥量。同時，脾虛模型組及脾腎兩虛模型組大鼠給予200%的大黃濃煎液灌胃，每周2次，如此給藥3個月。正常對照組、假手術(shù)組和腎虛模型組按同法灌服等體積的蒸餾水。

處死前16d和前3d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對骨進(jìn)行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后，取大鼠右側(cè)脛骨近端1/3制作不脫鈣骨切片，進(jìn)行骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的檢測。

1.5.2 不脫鈣骨切片的制作 取大鼠右側(cè)脛骨近端1/3，置于4%多聚甲醛溶液(PH7.4)中固定24h，然后進(jìn)行脫水，程序為80%乙醇2d，95%乙醇2d，100%乙醇2d，二甲苯2d。接著，標(biāo)本依次在塑料聚合液Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中各浸泡3d，以上固定、脫水和浸泡過程均在4℃進(jìn)行。最后，將400μLN，N-二甲基對甲苯胺(N，N-Dimethyl-p-toluidine)加入到100ml預(yù)冷(4℃)Ⅲ液中，用磁力攪拌器攪拌10min后，在青霉素小瓶中注入約7ml的Ⅲ液，將骨標(biāo)本按同一方向放入瓶底，用注射器抽空包埋瓶中空氣，然后置于-20℃冰箱中聚合1周左右，則可變?yōu)闊o色透明的堅硬包埋塊。修塊后，在 Reicheit-Jung2040切片機(jī)上，每塊骨組織用鎢鋼刀切出5μm的縱向不脫鈣骨切片各2張，其中1張用于甲苯胺藍(lán)染色，另1張用于熒光觀察。

1.5.3 指標(biāo)檢測 (1)大鼠行為學(xué)指標(biāo)觀察:根據(jù)經(jīng)典中醫(yī)理論及當(dāng)前證候規(guī)范化研究成果及大鼠的生物學(xué)特性，主要觀測大鼠的被毛狀況、活動狀況及排便狀況等;(2)骨組織形態(tài)計量學(xué)檢測法:用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計量分析:(1)骨量的檢測:用骨小梁體積百分比(TBV%)，即骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比進(jìn)行表示，它是衡量骨量水平的主要標(biāo)志;(2)骨吸收情況檢測:用骨小梁吸收表面百分比(TRS%)表示，即不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它也可以判斷破骨細(xì)胞的活性;(3)骨形成情況的檢測:①骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比，它也可以判斷成骨細(xì)胞的活性;②骨小梁礦化率(MAR):骨小梁表面熒光雙標(biāo)記帶的平均距離除以2次標(biāo)記相隔的天數(shù);③類骨質(zhì)平均寬度(OSW):皮質(zhì)內(nèi)表面有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)的平均寬度;④骨皮質(zhì)礦化率(mAR):皮質(zhì)內(nèi)表面熒光雙標(biāo)記帶的平均距離除以2次標(biāo)記相隔的天數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)改變

正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈活，活動敏捷，被毛光澤，飲食正常，體重日漸增加。脾虛模型組和脾腎兩虛模型組大鼠均出現(xiàn)毛色不光、食量減少、行為遲緩、喜聚堆、弓背蜷縮、稀便等與臨床脾虛證相似的癥狀。

2.2 脾虛、腎虛及脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠脛骨TBV%的變化

表1顯示，腎虛及脾腎兩虛模型組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術(shù)組，脾虛模型組的TBV%與假手術(shù)組相比無明顯差異。己烯雌酚組大鼠脛骨TBV%均顯著高于脾腎兩虛模型組，但明顯低于假手術(shù)組。與腎虛模型組相比，脾腎兩虛模型組大鼠脛骨TBV%降低更為明顯。

2.3 脾虛、腎虛及脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠脛骨TRS%和TFS%的變化

表2顯示，與假手術(shù)組相比，腎虛及脾腎兩虛模型組大鼠脛骨TRS%和TFS%均顯著增高，而脾虛模型組無明顯差異。己烯雌酚組大鼠脛骨TRS%和TFS%均顯著低于脾腎兩虛模型組，相較于假手術(shù)組無明顯差異。與腎虛模型組相比，脾腎兩虛模型組大鼠脛骨TRS%和TFS%增高更為明顯。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

表2 各組大鼠脛骨TRS%和TFS%的變化

2.4 脾虛、腎虛及脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松大鼠脛骨OSW、MAR和 mAR的變化

表3顯示，腎虛及脾腎兩虛模型組大鼠脛骨OSW、MAR和 mAR較之假手術(shù)組均顯著增高，而脾虛模型組無明顯差異。與脾腎兩虛模型組相比，己烯雌酚組大鼠脛骨 OSW、MAR和 mAR均顯著降低。與腎虛模型組相比，脾腎兩虛模型組大鼠脛骨MAR和mAR增高更為顯著。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)“骨痹”或“骨痿”范疇?！鹅`樞·經(jīng)脈》曰:“足少陰氣絕則骨枯……骨不濡則肉不能著也，骨肉不相親則肉軟卻……發(fā)無澤者骨先死?！薄澳I為先天之本”，“腎生骨髓”，“其充在骨”。可見，骨的生長、發(fā)育、強(qiáng)勁、衰弱與腎精盛衰關(guān)系密切，腎精充足則骨髓生化有源，骨骼得以滋養(yǎng)而強(qiáng)健有力;腎精虧虛則骨髓生化乏源，骨骼失養(yǎng)而痿弱無力。從以上論述可以看出，腎虛是引起骨質(zhì)疏松癥的根本原因。長期的研究表明，中醫(yī)“腎”與內(nèi)分泌功能密切相關(guān)，其至少包涵了“下丘腦-垂體-性腺軸”、“下丘腦-垂體-甲狀腺軸”和“下丘腦-垂體-腎上腺軸”的功能，其功能紊亂是腎虛證的一種表現(xiàn)［2］。諸多研究已證實［3，4］，切除卵巢可造成腎虛型骨質(zhì)疏松癥動物模型，因此本實驗采用卵巢切除的方法建立大鼠腎虛型骨質(zhì)疏松模型。結(jié)果顯示，腎虛模型組大鼠代表骨量的指標(biāo)TBV%顯著低于假手術(shù)組，代表骨吸收情況的指標(biāo)TRS%以及代表骨形成情況的指標(biāo)TFS%、OSW、MAR和 mAR均顯著增高，說明卵巢切除可使大鼠的骨量顯著降低，使其骨形成和骨吸收均增高，造成了高轉(zhuǎn)換的骨質(zhì)疏松癥模型。這與我們以往的研究結(jié)果相一致［5～7］。

表3 各組大鼠脛骨OSW、MAR和 mAR的變化

脾虛動物模型則選用目前公認(rèn)的大黃所致的脾虛證動物模型［8，9］。理論依據(jù)為中醫(yī)文獻(xiàn)中導(dǎo)致脾虛的有關(guān)論述，如李杲“大忌苦寒之藥損其脾胃”，李時珍對大黃“其性苦寒，能傷元氣耗陰血”的論述等。大黃脾虛證動物模型是我國最早的脾虛模型之一，應(yīng)用時間長，并積累了較多的實驗研究資料。中醫(yī)亦認(rèn)為，“脾為后天之本”，脾主運化，輸布精微，可充養(yǎng)腎精。若脾氣虛弱，中陽不振，精微不布，則腎精乏源，進(jìn)而使骨髓失養(yǎng)而致骨痿。因此，脾虛可通過導(dǎo)致腎虛進(jìn)而引起骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。通過實驗中的觀察，灌胃給予大黃濃煎液14 d后，脾虛模型組和脾腎兩虛模型組大鼠均表現(xiàn)出毛色不光、食量減少、行為遲緩、喜聚堆、弓背蜷縮、反應(yīng)不靈敏等與臨床脾虛證相似的癥狀。但骨形態(tài)計量結(jié)果顯示，脾虛模型組大鼠的TBV%、TRS%、TFS%、OSW、MAR和 mAR與假手術(shù)組相比無明顯差異，說明單純的脾虛并未造成大鼠的骨質(zhì)疏松癥。

脾腎兩虛模型的制作結(jié)合了上述腎虛和脾虛模型的造模方法，即先行卵巢切除術(shù)，術(shù)后10周開始灌胃給予200%大黃濃煎劑，4ml/只，每日1次，連續(xù)給藥14 d。為鞏固脾虛的狀態(tài)，在隨后的3個月中，仍然給予200%大黃濃煎劑4ml/只，每周2次。實驗結(jié)果顯示，脾腎兩虛模型組大鼠TBV%與假手術(shù)組相比顯著降低，TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR明顯增高。這一結(jié)果說明，該模型造成的是一種骨形成和骨吸收均增高，而骨吸收大于骨形成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，這與臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病理表現(xiàn)是一致的。另一方面也說明，雖然單純脾虛不能造成大鼠骨質(zhì)疏松癥，但在卵巢切除術(shù)后再給予大黃濃煎劑，即在腎虛的基礎(chǔ)上疊加脾虛的因素則可導(dǎo)致大鼠的骨質(zhì)疏松，造成骨質(zhì)疏松脾腎兩虛模型。而脾腎兩虛模型與腎虛模型組相比，大鼠的TBV%降低更為明顯，且 TRS%、TFS%、MAR和 mAR增高更為明顯。說明在腎虛的基礎(chǔ)上疊加脾虛的因素，可使其骨量減少更加嚴(yán)重，骨轉(zhuǎn)換率的增高更為顯著，也就是造成了較單純腎虛更為嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松癥。這印證了中醫(yī)“脾腎相關(guān)”理論的正確性。中醫(yī)理論認(rèn)為，“脾腎相關(guān)”，即脾腎兩臟聯(lián)系密切，它們在生理上相互資生，病理上相互影響。在生理狀態(tài)下，脾主運化水谷精微，需借助腎中陽氣的溫煦，而腎中精氣亦有賴于水谷精微的不斷充實和營養(yǎng);在病理過程中，腎陽不足，不能溫煦脾陽，或脾虛日久，精微不能充養(yǎng)腎精，最終均可導(dǎo)致脾腎兩虛。近代研究亦認(rèn)為，脾虛和腎虛在人體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等方面相互關(guān)聯(lián)。中醫(yī)“脾腎相關(guān)”的理論也詮釋了為何在脾虛并未造成骨質(zhì)疏松的情況下，在腎虛基礎(chǔ)上疊加脾虛的因素卻加重了發(fā)病的程度。至于單純的脾虛并未造成大鼠骨質(zhì)疏松的原因，我們分析可能是因為給藥時間尚短，脾虛程度不甚嚴(yán)重，還未引起腎虛進(jìn)而造成大鼠的骨質(zhì)疏松。但也說明骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，腎虛才是其根本原因，脾虛是主要因素，“脾腎相關(guān)”，兩臟俱虛進(jìn)而共同導(dǎo)致該病的發(fā)生。

綜上所述，去卵巢能夠造成大鼠腎虛型骨質(zhì)疏松癥，而單純給予大黃濃煎劑可造成大鼠脾虛，但不能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。若將去卵巢和灌胃給予大黃2種方法合用，可造成大鼠脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥，且發(fā)病程度較單純?nèi)ヂ殉裁黠@加重。該模型有明顯的脾虛證候特征，且其骨質(zhì)疏松的病理過程與人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相似，能反映脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松患者的發(fā)病特點，具有可行性。

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