丙戊酸鈉逆轉(zhuǎn)組蛋白低乙?；綄Ω伟┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的體外實驗研究

高峰 楊季紅 張愛民 馬芳 康然

丙戊酸鈉(sodium valproate，VPA)是目前臨床應(yīng)用廣泛的抗癲癇藥物，近期研究發(fā)現(xiàn)其具有很強的組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylase inhibitor，HDACI)活性［1］，其通過逆轉(zhuǎn)組蛋白低乙?；剑险{(diào)相關(guān)抑癌基因表達(dá)，起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡或者誘導(dǎo)分化，同時還具有抑制腫瘤血管新生、抑制瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用［2］，在白血病及多種實體瘤中顯現(xiàn)出較好的抗腫瘤效應(yīng)，但其具體作用機制尚未明了。本研究通過觀察VPA對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，并觀察VPA對該細(xì)胞系體外侵襲、遷移和黏附能力的影響以及對乙酰肝素酶(heparanase，HPA)和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討VPA的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所提供。VPA(Sigma公司);RPMI-1640培養(yǎng)基及Trizol試劑(Gibco公司);胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司);Annexin-V-FITC凋亡分析試劑盒(Becton Dickinson公司);Matrigel膠、Transwell小室(BD公司);Cytobuster TM細(xì)胞裂解液(Novagen公司);山羊抗人 HPA、PCNA、β-actin(Santa Cruz Biotechnology公司);辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊二抗及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組:肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2(體積分?jǐn)?shù))、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長達(dá)亞融合狀態(tài)時，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞備用。實驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期，苔盼藍(lán)計數(shù)活細(xì)胞大于95%。設(shè)VPA濃度梯度為2、4、8 mmol/L為試驗組(n=3)，以等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)為對照組(n=3)，培養(yǎng)24、48或72 h。

1.2.2 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期:不同濃度VPA作用細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌兩遍，1×Annexin-V緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取懸液 100 μl，加入 Annexin-V-FITC 5 μl、碘化丙啶(PI)10 μl，避光染色15 min，每管加入300 μl的1×Annexin-V緩沖液，F(xiàn)CM檢測凋亡細(xì)胞陽性率和細(xì)胞周期變化，并以FCM檢測結(jié)果作為后繼試驗選擇藥物濃度和作用時間的參考依據(jù)。Annexin-V(-)并PI(-)為活細(xì)胞，Annexin-V(-)并PI(+)為機械損傷細(xì)胞，Annexin-V(+)并PI(+)為晚期凋亡細(xì)胞，試驗中以Annexin-V(+)作為凋亡細(xì)胞。

1.2.3 肝癌細(xì)胞體外遷移實驗:SMMC-7721細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至單層細(xì)胞覆蓋率90%左右，更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)12 h。用橡皮刮片在孔板中央刮出一條整齊的寬度為10 mm無細(xì)胞劃痕區(qū)，輕輕洗滌后棄上清，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)液2 ml，并在孔內(nèi)分別加入空白對照 PBS液和2、4、8 mmol/L的VPA。37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h。顯微鏡下放大100倍觀察刮痕區(qū)，每孔隨機選擇5個視野，計數(shù)每個視野中向刮痕中遷移的細(xì)胞總數(shù)。

細(xì)胞遷移抑制率(%)=(對照組遷移細(xì)胞數(shù)-試驗組遷移細(xì)胞數(shù))/對照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 肝癌細(xì)胞體外侵襲實驗:Transwell小室的聚碳酯膜下表面使用0.1%的明膠室溫包被過夜，上表面加入20 μl Matrigel，37℃、5%CO2下溫育1 h使膠凝固，用來模擬體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜環(huán)境。SMMC-7721細(xì)胞制成2×105/ml細(xì)胞懸液，取 200 μl接種于 Transwell小室上室，分別加入 2、4、8 mmol/L的VPA，同時設(shè)對照組。下室中加入含10%FBS的NIH-3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。去除濾膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定后行瑞氏吉姆薩染色。鏡下(×200)隨機選取5個視野，計數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。以穿膜細(xì)胞相對數(shù)目表示SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力并計算侵襲抑制率。

細(xì)胞侵襲抑制率(%)=(對照組穿膜細(xì)胞數(shù)-試驗組穿膜細(xì)胞數(shù))/對照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 肝癌細(xì)胞體外黏附能力試驗:不同濃度(2、4、8 mmol/L)的VPA作用SMMC-7721細(xì)胞24 h，以含10%血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按2×105/孔接種于預(yù)先鋪好Matrigel的96孔板，設(shè)4個平行孔，繼續(xù)孵育60 min后每孔加入無血清的RPMI1640 培養(yǎng)基200 μl和 MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育4 h。棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，震蕩 10 min，在全自動酶標(biāo)儀492 nm波長處測定吸光度(OD)值。

細(xì)胞黏附率(%)=試驗組OD值/對照組OD值×100%。1.2.6 Western-blot法測定SMMC-7721細(xì)胞HPA及PCNA蛋白含量:收獲細(xì)胞后，冰PBS漂洗2次，收集細(xì)胞，立即加入500 μl細(xì)胞裂解液，冰上靜置 10 min，4℃、14 000 r/min離心10 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，加入1∶300稀釋的山羊抗人HPA多克隆抗體或山羊抗人PCNA多克隆抗體或1∶300稀釋的山羊抗人β-actin作為陽性對照，4℃過夜，用含0.1%Tween20的TBS洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗山羊二抗，37℃中作用1 h，洗膜后DAB顯色。將結(jié)果掃描成像后用GeL-ProAnalysis圖像分析軟件進(jìn)行條帶吸光度值分析，以HPA(50 kU)、PCNA(36 kU)與β-actin(42 kU)測定結(jié)果的比值，作為 HPA和PCNA蛋白表達(dá)水平的參數(shù)，對HPA和PCNA產(chǎn)物相對定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期變化 經(jīng)2、4、8 mmol/L VPA作用細(xì)胞48 h后FCM顯示，隨著VPA濃度增加，SMMC-7721細(xì)胞凋亡率逐漸增高。以8 mmol/L VPA分別作用細(xì)胞24、48及72 h后，檢測細(xì)胞凋亡率亦逐漸增高，各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期、S期細(xì)胞百分率逐漸下降，而G2/M期細(xì)胞百分率逐漸升高，且呈濃度和時間依賴性(P＜0.05)。表1、2。

表1 不同濃度VPA作用48 h后SMMC-7721細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期改變n=3，%，±s

表1 不同濃度VPA作用48 h后SMMC-7721細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期改變n=3，%，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與2 mmol/L組比較，#P＜0.05;與4 mmol/L組比較，△P＜0.05

組別 凋亡率 G0/G1期 S期 G2/M期3.7±0.3 58.5±1.7 30.3±0.9 9.02±0.29 2 mmol/L組 9.7±0.4* 52.3±1.0* 25.2±0.9* 13.68±0.36*4 mmol/L組 19.8±1.1*# 47.4±1.4*# 19.3±0.7*# 18.69±0.80*#8 mmol/L組 35.6±1.7*#△ 39.6±1.2*#△ 11.0±1.1*#△ 23.98±1.32*#△對照組

表2 8 mmol/L VPA作用不同時間后SMMC-7721細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期改變n=3，%，±s

表2 8 mmol/L VPA作用不同時間后SMMC-7721細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期改變n=3，%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與24 h組比較，#P ＜0.05;與48 h組比較，△P ＜0.05

組別 凋亡率 G0/G1期 S期 G2/M期1.6±0.3 57.2±1.0 31.3±0.7 8.96±0.21 24 h 28.7±0.7* 48.4±1.0* 20.4±0.8* 19.38±0.82*48 h 35.6±1.7*# 39.6±1.2*# 11.0±1.1*# 23.98±1.32*#72 h 46.1±1.3*#△ 43.3±1.0*#△ 9.1±0.9*#△ 26.31±1.02*#△對照組(24 h)

2.2 肝癌細(xì)胞體外遷移實驗 不同濃度的VPA作用細(xì)胞24 h后，對照組向劃痕部位遷移細(xì)胞數(shù)目多于VPA試驗組，細(xì)胞遷移數(shù)目隨藥物濃度升高而逐漸減少，該作用呈濃度依賴性，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

2.3 肝癌細(xì)胞體外侵襲實驗 不同濃度的VPA試驗組穿膜細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，且呈現(xiàn)出濃度依賴性，計算得出細(xì)胞侵襲抑制率亦隨實驗濃度升高而逐漸升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

2.4 肝癌細(xì)胞體外黏附能力試驗 VPA試驗組吸光度(OD)值明顯低于對照組，隨VPA濃度由2、4、8 mmol/L遞增，計算得出各濃度組細(xì)胞黏附率呈降低趨勢，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

2.5 SMMC-7721細(xì)胞HPA及PCNA蛋白含量的變化 Western-blot結(jié)果顯示，對照組HPA和PCNA蛋白表達(dá)水平較高，隨著VPA濃度的升高，HPA和PCNA蛋白表達(dá)水平逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，存在濃度依賴性(P＜0.05)。同一濃度下隨作用時間延長，該下調(diào)作用亦逐漸加強，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即存在時間依賴性(P＞0.05)。見表4。

表3 不同濃度VPA對SMMC-7721細(xì)胞遷移、侵襲、黏附能力的影響n=3，%，±s

表3 不同濃度VPA對SMMC-7721細(xì)胞遷移、侵襲、黏附能力的影響n=3，%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與2 mmol/L組比較，#P ＜0.05;與4 mmol/L組比較，△P ＜0.05

組別 細(xì)胞遷移抑制率 細(xì)胞侵襲抑制率 細(xì)胞黏附率對照組000 2 mmol/L組 31.36±0.07* 45.68±0.05* 68.95±4.36*4 mmol/L組 58.21±0.08# 65.65±0.03# 42.63±4.62#8 mmol/L組 69.89±0.08#△ 76.92±0.06#△ 18.59±3.69#△

表4 不同濃度VPA作用不同時間SMMC-7721細(xì)胞HPA和PCNA蛋白含量測定n=3，±s

表4 不同濃度VPA作用不同時間SMMC-7721細(xì)胞HPA和PCNA蛋白含量測定n=3，±s

注:與對照組比較，*P＜0.05;與A組比較，#P＜0.05;與B組比較，△P＜0.05;與同一濃度組24 h比較，☆P＜0.05;與同一濃度組48 h比較，▲P＜0.05

作用時間 對照組 VPA 試驗組A組(2 mmol/L) B組(4 mmol/L) C組(8 mmol/L)HPA 24 h 2.205±0.086 1.908±0.156* 1.555±0.070*# 0.881±0.047*#△△☆▲48 h 2.339±0.092 1.695±0.162＊☆ 1.327±0.118*#☆ 0.639±0.081*#△☆72 h 2.345±0.091 1.593±0.107＊☆▲ 1.025±0.149*#☆▲ 0.597±0.008*#△☆▲PCNA 24 h 2.325±0.100 2.162±0.163* 1.773±0.097*# 1.141±0.061*#△48 h 2.354±0.205 1.829±0.071＊☆ 1.565±0.061*#☆ 0.897±0.120*#△☆72 h 2.361±0.168 1.699±0.109＊☆▲ 1.251±0.073*#☆▲ 0.561±0.101*#

3 討論

肝細(xì)胞性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤死亡分類構(gòu)成中高居第二位［3］。目前認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生最終由基因組水平的改變引起，是一個多基因事件累積的復(fù)雜過程。其中，組蛋白的乙?；{(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其由一對功能相互拮抗的蛋白酶，即組蛋白乙?；?histoneacetylase，HAT)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylase，HDAC)共同調(diào)控，二者之間的動態(tài)平衡控制著染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因的正常有序表達(dá)。已有研究報道，HDAC水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［4］，而HDACI可通過促進(jìn)組蛋白乙?；?，上調(diào)相關(guān)抑癌基因表達(dá)，起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡或者誘導(dǎo)分化的作用［1］，但其作用機制尚未闡明。VPA是臨床常用的抗癲癇藥，最近研究發(fā)現(xiàn)它有較強的HDACI活性［2］。研究證明HDACI可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移、降低腫瘤侵襲力等機制發(fā)揮抗腫瘤作用［5］。

本研究觀察了VPA對SMMC-7721細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示隨著VPA濃度增加和作用時間的延長，SMMC-7721細(xì)胞凋亡率逐漸增高，表明 VPA對SMMC-7721細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。細(xì)胞周期分析顯示隨著VPA濃度增加，G0/G1期、S期細(xì)胞百分率逐漸下降，分別由(58.53±1.68)%、(30.32±0.87)%降至(39.64±1.22)%、(11.02±1.09)%。而G2/M期細(xì)胞百分率逐漸升高，由(9.02±0.29)%增至(23.98±1.32)%，提示VPA能使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，這與Kaiser等［6］的研究結(jié)果一致。PCNA作為DNA聚合酶δ的輔助蛋白直接參與DNA的合成，其表達(dá)與細(xì)胞周期相關(guān)，是評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的生物學(xué)活性指標(biāo)［7］。有研究表明，PCNA異常表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)［8］。本實驗同時觀察到不同濃度的VPA作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞不同時間后，細(xì)胞中PCNA蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，并呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性。提示VPA可能通過下調(diào)PCNA的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖化。

細(xì)胞體外遷移實驗、侵襲試驗以及黏附能力試驗均為體外模擬并檢測腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)特性的經(jīng)典試驗方法。腫瘤細(xì)胞的黏附是惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的始發(fā)步驟，黏附作用包括同質(zhì)黏附(細(xì)胞—細(xì)胞黏附)和異質(zhì)黏附(細(xì)胞—基質(zhì)黏附)，同質(zhì)黏附能力下降，有利于瘤細(xì)胞脫離原發(fā)腫瘤而向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，異質(zhì)黏附能力增強則有利于轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移處的基質(zhì)結(jié)合，繼而釋放蛋白酶降解基質(zhì)，便于瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位侵襲性生長。參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子成員眾多，HPA是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物細(xì)胞中唯一能切割細(xì)胞外基質(zhì)中HSPG側(cè)鏈的內(nèi)源性糖苷酶，通過破壞基底膜的完整性，促進(jìn)腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移，同時還可促進(jìn)VEGF、bFGF等腫瘤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，其在腫瘤中的高表達(dá)提示預(yù)后不良［9，10］。而應(yīng)用反義寡核苷酸或RNA干擾技術(shù)降低肝癌細(xì)胞HPA的表達(dá)，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力［11］。本試驗將不同濃度VPA作用SMMC-7721細(xì)胞不同時間，觀察瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，結(jié)果表明，試驗組細(xì)胞遷移能力、侵襲能力以及細(xì)胞黏附能力均顯著低于對照組，提示VPA能顯著抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。試驗進(jìn)一步檢測了VPA對SMMC-7721細(xì)胞 HPA表達(dá)的影響，Western-blot結(jié)果顯示，對照組HPA蛋白表達(dá)水平較高，而試驗組隨著VPA濃度的升高和作用時間的延長，HPA蛋白表達(dá)水平第次下降，存在濃度依賴性和時間依賴性。提示VPA可通過降低SMMC-7721細(xì)胞HPA的表達(dá)，弱化瘤細(xì)胞降解突破基底膜以及與轉(zhuǎn)移處基質(zhì)的黏附能力，間接發(fā)揮其抑制瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抗腫瘤效應(yīng)。

綜上所述，本試驗應(yīng)用VPA逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞組蛋白低乙?；揎椝?，可顯著抑制癌細(xì)胞增殖，降低癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。下調(diào)HPA和PCNA表達(dá)可能是其發(fā)揮作用的主要機制之一。VPA作為新近證實的HDACI在肝癌的治療方面存在較好的應(yīng)用前景。

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