選擇性激光小梁成形術(shù)對(duì)小梁網(wǎng)顯微結(jié)構(gòu)影響及降壓機(jī)制研究

李忠強(qiáng) 閆小四 馬景學(xué)

病理性高眼壓是青光眼相關(guān)視神經(jīng)損害的最危險(xiǎn)因素，故降低和穩(wěn)定眼內(nèi)壓至靶水平是青光眼治療的首要任務(wù)。目前臨床降低眼壓的方法主要有藥物、手術(shù)和激光療法三種。氬激光小梁成形術(shù)(argon laser trabeculoplasty，ALT)可成功降低原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)的眼內(nèi)壓［1］，但降壓效果不持久，可能與ALT對(duì)眼前房角小梁網(wǎng)造成凝固性破壞并對(duì)周圍無(wú)色素細(xì)胞和組織產(chǎn)生熱損傷有關(guān)［2］。為解決上述問(wèn)題，自1995年對(duì)選擇性作用于色素性小梁激光進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了倍頻Q開(kāi)關(guān)Nd:YAG激光能選擇性作用于色素性小梁細(xì)胞，具有確切降低眼壓效果，對(duì)周圍組織無(wú)熱損傷和凝固作用，即選擇性激光小梁成形術(shù)(selective laser trabeculoplasty，SLT)［3］。SLT的應(yīng)用為開(kāi)角型青光眼患者的治療開(kāi)辟了一條安全有效的新途徑。本實(shí)驗(yàn)采用組織形態(tài)學(xué)觀察彌猴眼SLT術(shù)后眼前房角小梁網(wǎng)組織的顯微結(jié)構(gòu)改變，探討SLT降低眼內(nèi)壓的可能機(jī)制，使該技術(shù)在臨床上得到合理應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年恒河猴6只，雌雄各3只，體重6～7 kg，年齡3～4歲。由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物室提供。術(shù)前常規(guī)眼科檢查(裂隙燈、眼底鏡、房角鏡、眼壓計(jì))，排除眼病和前房角結(jié)構(gòu)變異，房角為開(kāi)角型。

1.2 主要儀器設(shè)備 裂隙燈顯微鏡(TOPCON，日本)，間接眼底鏡(Ra-200型，北京)，壓陷式眼壓計(jì)(蘇州)，手術(shù)顯微鏡(OMS610，TOPCON，日本)，Lumenis Selecta dute 激光器(美國(guó))，Olympus顯微鏡(日本)，掃描電子顯微鏡(日立S-3500N，日本)，透射電子顯微鏡(日立H-7500，日本)，LEICA顯微照相系統(tǒng)(德國(guó))。

1.3 主要溶液配制 A液:磷酸二氫鉀1.816 g溶于200 ml雙蒸水;B液:磷酸二氫鈉5.5 g溶于200 ml雙蒸水。4%戊二醛固定液配制:A液(10 ml)+B液(50 ml)+25%戊二醛原液(12 ml);2.5%戊二醛固定液配制:4%戊二醛(95 ml)+50%戊二醛原液(5 ml)。

1.4 SLT治療步驟 分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)猴1～6號(hào)，術(shù)前6 h禁食水，按每公斤體重10 mg肌內(nèi)注射氯胺酮全身麻醉后行右眼愛(ài)爾卡因表面麻醉，置專用房角鏡，接受lumenis selecta dute激光器治療，采用SLT檔激光即倍頻Q-開(kāi)關(guān)ND:YAG激光，照射范圍為上方180°小梁網(wǎng)。治療參數(shù):波長(zhǎng)532 nm，脈沖時(shí)間3 ns，光斑直徑400 μm，光斑相鄰但不重疊，點(diǎn)數(shù)50～80個(gè)。初始能量設(shè)置為0.8 mJ，以剛能看到激光照射點(diǎn)出現(xiàn)小氣泡后減少0.1 mJ為治療能量。左眼做為正常對(duì)照。術(shù)后1周，6只實(shí)驗(yàn)彌猴行雙眼上方小梁切除術(shù)，小梁組織大小約2×3 mm，1、3、5號(hào)猴做掃描電鏡觀察，2、4、6號(hào)猴做透射電鏡觀察。

1.5 掃描電鏡步驟 小梁組織標(biāo)本迅速放入2.5%戊二醛中固定4 h以上，雙蒸餾水浸洗4次;50%、70%、80%和90%乙醇逐級(jí)脫水，然后置入100%乙醇脫水2次，每次20 min。叔丁醇干燥，75%液20 min，100%液2次，每次20 min，真空干燥2 h;標(biāo)本噴金，觀察與照相。

1.6 透射電鏡步驟 小梁組織標(biāo)本迅速放入4%戊二醛前固定4～6 h，1/15 mol/L磷酸緩沖液浸洗3次以上;1%四氧化鋨后固定1～2 h;1/15 mol/L磷酸緩沖液浸洗2次，每次20 min;丙酮逐級(jí)脫水50%、70%、80%、90%、100%2次，每次15 min。之后浸透與包埋:純丙酮:包埋劑(1∶1)37℃溫箱1 h，再置入純丙酮:包埋劑(1∶3)37℃溫箱3 h以上，最后純包埋劑浸透37℃溫箱5 h以上。50 μm超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，電鏡觀察與照相。

2 結(jié)果

2.1 正常彌猴眼前房角小梁網(wǎng)電鏡結(jié)果 正常彌猴眼前房角小梁網(wǎng)由基質(zhì)、膠原纖維、彈性纖維和內(nèi)皮細(xì)胞組成。中心為膠原纖維，埋于均勻基質(zhì)中。膠原纖維間有少量彈性纖維。小梁網(wǎng)的表面覆蓋一層內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞寬而扁平，有突起，有的突起很長(zhǎng)，與相鄰細(xì)胞連接成單層網(wǎng)狀(圖1)。內(nèi)皮細(xì)胞中含有豐富膜樣細(xì)胞器。

2.2 SLT治療后1周小梁網(wǎng)電鏡結(jié)果 掃描電鏡觀察小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，小梁柱層次清楚，沒(méi)有見(jiàn)到凝固性損傷及熱損傷，只有小梁限局性的裂隙樣改變，小梁網(wǎng)間隙中可見(jiàn)較多體積較大的吞噬細(xì)胞(對(duì)照組未見(jiàn))(圖2、3);透射電鏡下見(jiàn)色素性小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)部分黑色素顆粒崩解、外溢(圖4A、B)。

圖1 正常獼猴小梁網(wǎng)掃描電鏡，小梁網(wǎng)由基質(zhì)、膠原纖維、彈性纖維和內(nèi)皮細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)清晰(SEM×700)

圖2 SLT后1周獼猴小梁網(wǎng)掃描電鏡，小梁組織限局性裂隙樣改變(箭頭)。無(wú)凝固性損傷及熱損傷改變(SEM×2 000)

圖4A 正常彌猴眼前房角小梁網(wǎng)透射電鏡(TEM)，色素性小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)密集的色素顆粒(箭頭)(TEM×20 000)

圖4B SLE后1周獼猴小梁網(wǎng)透射電鏡，色素性小梁網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)部分黑色素顆粒崩解、外溢(箭頭)(TEM×20 000)

圖3 SLT后1周獼猴小梁網(wǎng)掃描電鏡，小梁網(wǎng)間隙中可見(jiàn)較多體積較大的吞噬細(xì)胞(箭頭)(SEM×1 200)

3 討論

開(kāi)角型青光眼除傳統(tǒng)的藥物療法和手術(shù)治療外，還可通過(guò)激光治療降低眼壓?？骨喙庋鬯幬镏委熓且环N終身療法，不僅患者依從性差，有藥物漂移現(xiàn)象，且治療費(fèi)用昂貴，患者常難以堅(jiān)持治療，因此開(kāi)角型青光眼的激光療法越來(lái)越受到重視。1979年Wise和Witter首次報(bào)告用低能量氬離子激光ALT治療POAG，其降壓機(jī)制尚無(wú)定論，一般認(rèn)為是激光的熱效應(yīng)使小梁纖維板層收縮，加寬了小梁間隙，同時(shí)打開(kāi)了Schlemm’s管，從而減少了房水排出阻力而降低眼壓［4］。經(jīng)二十余年的臨床實(shí)踐，ALT的安全性和有效性已得到臨床醫(yī)生的廣泛接受，但ALT對(duì)小梁網(wǎng)可造成凝固性破壞并對(duì)周圍無(wú)色素細(xì)胞和組織產(chǎn)生熱損傷，且在激光斑之間形成膜樣結(jié)構(gòu)和瘢痕組織，從而使降眼壓效果不能持久，并限制了激光治療的重復(fù)應(yīng)用和進(jìn)一步藥物治療的效果［2，3，5，6］。由于上述缺點(diǎn)，ALT 仍不能代替抗青光眼藥物成為治療開(kāi)角型青光眼的首要選擇。

為了解決上述問(wèn)題，1995年Latina和Park發(fā)明了選擇性激光小梁成形術(shù)(SLT)，應(yīng)用于治療POAG并取得了良好療效。SLT采用Q開(kāi)關(guān)、倍頻Nd:YAG激光，脈沖時(shí)間3 ns，激光光斑400 μm，激光波長(zhǎng)532 nm，脈沖能量小于2 mJ。選擇性作用于色素性小梁細(xì)胞，使鄰近組織不受損害，保持了小梁組織的結(jié)構(gòu)完整，彌補(bǔ)了ALT的不足。

3.1 采用彌猴眼小梁組織標(biāo)本進(jìn)行SLT研究的意義 因臨床上患者接受SLT治療后短期內(nèi)再行小梁切除術(shù)的病例很少，且因手術(shù)限制不能進(jìn)行與自身正常小梁組織的對(duì)照，而彌猴眼小梁組織結(jié)構(gòu)與人眼雖然有些差別(如其小梁較人眼短而粗)，但與人眼小梁有相似的超微結(jié)構(gòu)，故我們采用猴眼小梁組織標(biāo)本進(jìn)行對(duì)SLT術(shù)后顯微結(jié)構(gòu)的研究。本實(shí)驗(yàn)之所以選擇對(duì)SLT術(shù)后1周時(shí)的猴眼小梁組織進(jìn)行電鏡觀察，是因?yàn)檩^長(zhǎng)時(shí)間和較多時(shí)間點(diǎn)的顯微觀察需要更多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源困難，數(shù)量有限，我們只能選擇炎性反應(yīng)和顯微結(jié)構(gòu)改變都趨于穩(wěn)定的術(shù)后1周這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，這是本實(shí)驗(yàn)的不足。本實(shí)驗(yàn)電鏡結(jié)果表明，SLT術(shù)后掃描電鏡檢查未發(fā)現(xiàn)小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)破壞，未發(fā)現(xiàn)有凝固性損傷及熱損傷，只有局部小梁架的裂隙樣改變，小梁間隙中可見(jiàn)體積較大的吞噬細(xì)胞(對(duì)照組未見(jiàn))。透射電鏡顯示色素性小梁內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒崩解，外溢。這與國(guó)外研究結(jié)果相同，Kramer等［7］在比較人尸體眼球SLT和ALT術(shù)后電子顯微鏡下急性形態(tài)學(xué)改變時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與ALT不同，SLT術(shù)后小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)凝固性損傷，機(jī)械性損傷(局部小梁斷裂)也比較少，激光的顯微證據(jù)表現(xiàn)為透射電鏡顯示的色素性小梁內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)黑色素顆粒崩解和小梁內(nèi)皮細(xì)胞破壞。以上結(jié)果證實(shí)了Latina的說(shuō)法，即SLT選擇性作用于色素性小梁細(xì)胞而對(duì)無(wú)色素細(xì)胞及周圍組織結(jié)構(gòu)無(wú)熱損傷及凝固作用。

3.2 SLT的降壓機(jī)制 激光的選擇性光熱解效應(yīng)理論認(rèn)為，要使激光對(duì)靶組織具有高度特異性，須具備三個(gè)條件:(1)細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì)含量遠(yuǎn)多于周圍組織;(2)激光波長(zhǎng)與靶組織吸收波長(zhǎng)相符;(3)激光脈沖時(shí)間小于或等于靶組織的熱馳豫時(shí)間(即靶組織將電磁能轉(zhuǎn)化為熱能所需的時(shí)間)。SLT的治療作用就是通過(guò)上述原理實(shí)現(xiàn)的，它提供了產(chǎn)生極短的激光脈沖的物質(zhì)基礎(chǔ)。另一方面，SLT的作用對(duì)靶組織有一定要求:(1)靶細(xì)胞內(nèi)含有色素;(2)靶細(xì)胞必須比其周圍的組織容易吸收激光能量。人眼功能小梁由兩種細(xì)胞組成，即含有色素的小梁細(xì)胞和不含色素的小梁細(xì)胞。因此，人眼功能小梁提供了SLT選擇性光熱解作用的靶細(xì)胞。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，SLT不同于ALT，它只選擇性作用于色素性小梁細(xì)胞，對(duì)無(wú)色素細(xì)胞和周圍組織不產(chǎn)生凝固性破壞和熱損傷，不會(huì)造成小梁間隙和Schlemm’s管的擴(kuò)張;同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，SLT術(shù)后小梁間隙中吞噬細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，故我們推測(cè)SLT降眼壓的機(jī)制存在于細(xì)胞水平。巨噬細(xì)胞可以修復(fù)由于損傷、疾病和老化引起的組織改變。SLT作用于小梁網(wǎng)后使單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，通過(guò)激活的巨噬細(xì)胞對(duì)殘留物和小梁組織色素顆粒的搬運(yùn)或吞噬作用增加小梁細(xì)胞的房水外流功能。Alvarado［8］等在對(duì)猴眼的研究中發(fā)現(xiàn)，SLT術(shù)后猴眼小梁網(wǎng)的單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞數(shù)量較未治療眼增加5～8倍，他們認(rèn)為，SLT術(shù)后引起的色素性小梁細(xì)胞損傷可導(dǎo)致多種細(xì)胞因子或化學(xué)因子的釋放，后者可激活單核細(xì)胞并使其轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞可以吞噬、清除小梁組織的色素顆粒，并經(jīng)Schlemm’s管運(yùn)出眼外，從而達(dá)到降低眼壓的效果。也有人認(rèn)為，SLT對(duì)色素細(xì)胞的損傷產(chǎn)生了細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子等，這些細(xì)胞因子中的一部分在減少金屬蛋白酶中起重要作用，而后者可以改變促進(jìn)房水外流的小梁網(wǎng)組織的細(xì)胞外基質(zhì)，從而增加房水外流量［8］。

綜上所述，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，SLT對(duì)小梁組織沒(méi)有熱損傷及凝固作用，可以保留小梁組織結(jié)構(gòu)的完整性，故可以重復(fù)治療，是較ALT更合理而安全的激光治療方法。

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