豬支原體肺炎活疫苗(168株)的安全性研究

劉茂軍，蘇國(guó)東，周勇岐，2，馮志新，王海燕，朱曉瑋，2，邵國(guó)青

(1．江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014;2．南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

豬支原體肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine，MPS)又稱豬地方性肺炎，該病是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一種豬慢性呼吸道傳染病，在全世界養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)普遍存在，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重危害［1－3］。疫苗預(yù)防是控制該病的主要手段［4］。豬肺炎支原體168株是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所連續(xù)傳代培育而成的適應(yīng)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基(KM2)的弱毒株。我們對(duì)該弱毒株的安全性進(jìn)行了研究，確保該菌株疫苗的臨床使用效果。

1 材料

1．1 疫苗、培養(yǎng)基和試劑 豬肺炎支原體168株(X+1)代(5×107CCU/mL)和3批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。5批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由南京天邦生物科技有限公司制造。豬肺炎支原體P46基因PCR引物由TaKaRa公司合成。KM2培養(yǎng)基和兔抗豬肺炎支原體J株高免血清由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所制備。

1．2 試驗(yàn)豬 5～15日齡豬75頭，仔豬和哺乳母豬均為豬肺炎支原體IHA抗體陰性，來(lái)源于江蘇省農(nóng)科院豬場(chǎng)，飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)科院試驗(yàn)動(dòng)物房，各組豬隔離飼養(yǎng)，飼喂無(wú)抗生素的飼料，飲用自來(lái)水。120頭商品豬來(lái)源于廣東某豬場(chǎng)，一直飼養(yǎng)與該豬場(chǎng)。

2 方法

2．1 感染性試驗(yàn) 用豬肺炎支原體168株X代肺內(nèi)注射接種5頭5～15 d齡試驗(yàn)豬，每頭1 mL，另5頭不注射作為崗哨組。在注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～4 d每日上午檢測(cè)直腸溫度;并于接種后連續(xù)逐日觀察臨床癥狀至剖殺前，主要觀察觀察是否有精神不振、食欲減退、呼吸困難、嘔吐、俯臥、震顫等不良癥狀。在注射后第25 d剖殺所有豬，采集肺臟，檢查是否存在組織病變。肺病變指數(shù)按照28分評(píng)分法判定［5］。

2．2 毒力返強(qiáng)試驗(yàn)

2．2．1 連續(xù)感染試驗(yàn) 用2 mL豬支原體肺炎活疫苗(168株)X代右側(cè)肺內(nèi)接種5頭5～15日齡試驗(yàn)豬，隔離單圈飼養(yǎng)25 d后，剖檢試驗(yàn)豬，觀察肺臟是否有胰樣小葉性肺炎病變，并以無(wú)菌操作分別從5頭豬右側(cè)肺臟剪取注射部位周圍肺組織約5～7 g剪成細(xì)塊，混合研磨成糊狀，加入含有1000單位/mL青霉素的Hank’s溶液，配制成5%肺懸液，當(dāng)日再肺內(nèi)接種到第二批5～15日齡健康易感豬5頭，2 mL/頭。如此反復(fù)連續(xù)接種5代，觀察每代次各接種豬臨床癥狀和肺臟的病理變化。

2．2．2 菌株鑒定 每代次剖殺的豬肺用P46 PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)豬支原體肺炎活疫苗(168株)菌體和第5次回歸豬的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析［6，7］。

2．3 不同免疫劑量安全性試驗(yàn) 3批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)肺內(nèi)接種健康豬進(jìn)行一次單劑量、單劑量重復(fù)和一次大劑量接種各5頭，分別注射1次1頭份、間隔2周2次各注射1頭份和1次10頭份，每頭份體積均為1 mL;對(duì)照組5頭豬同時(shí)肺內(nèi)接種1 mL生理鹽水。各組在當(dāng)日注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～3 d的每日檢測(cè)直腸溫度，并于接種后連續(xù)逐日觀察臨床癥狀至剖殺前。接種后第25 d將試驗(yàn)豬全部剖殺，采集肺臟，對(duì)注射部位特別檢查。

2．4 臨床安全性試驗(yàn) 用5批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)在豬場(chǎng)進(jìn)行免疫，每批次免20頭，1頭份/頭，對(duì)照20頭不免疫。對(duì)免疫組和對(duì)照組的各豬只在免疫前、免后6 h和免后24 h抽樣檢測(cè)直腸體溫，疫苗免疫后28 d內(nèi)進(jìn)行臨床觀察，觀察是否有精神不振、食欲減退、呼吸困難、嘔吐、俯臥、震顫等不良癥狀。

3 結(jié)果與分析

3．1 感染性試驗(yàn)結(jié)果

3．1．1 臨床癥狀觀察 仔豬注射豬支原體肺炎活疫苗(168株)后25 d內(nèi)，試驗(yàn)組和崗哨組的豬均表現(xiàn)正常，均未觀察到精神不振、食欲減退、咳嗽、呼吸困難、俯臥、嘔吐、震顫、死亡等不良反應(yīng)。提示豬支原體肺炎活疫苗(168株)對(duì)豬只的影響輕微，沒有可觀察到的臨床癥狀發(fā)生。

3．1．2 注射后的體溫變化 在所有測(cè)溫的時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組豬的直腸溫度平均值與對(duì)照組的相差范圍在0．5℃以內(nèi)。測(cè)得的每組平均直腸溫度見圖1。

3．1．3 大體病理觀察 在注射后25 d進(jìn)行剖檢，試驗(yàn)組與崗哨組均未觀察到豬支原體肺炎病變。提示該活疫苗免疫接種后未見眼觀肺臟病變，也未引起同圈豬發(fā)生眼觀肺臟病變。

圖1 豬注射當(dāng)日前后各時(shí)間的平均直腸溫度

3．2 毒力返強(qiáng)試驗(yàn)

3．2．1 臨床癥狀觀察和肺臟剖檢結(jié)果 豬支原體肺炎活疫苗(168株)進(jìn)行肺內(nèi)注射豬后，用肺臟懸液連續(xù)5次毒力返強(qiáng)接種試驗(yàn)豬的臨床觀察、肺臟剖檢結(jié)果見表1。

表1 連續(xù)5代毒力返強(qiáng)試驗(yàn)豬肺臟臨床癥狀、肺臟病變結(jié)果

豬支原體肺炎發(fā)病豬的典型癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、氣喘等［6］。由上表可見，豬支原體肺炎活疫苗(168株)肺內(nèi)注射易感豬均表現(xiàn)正常，未觀察到該病的臨床癥狀。第2～5代連續(xù)返強(qiáng)試驗(yàn)接種時(shí)，接種豬也未見明顯臨床反應(yīng)，病理剖檢均未產(chǎn)生眼觀典型的豬支原體肺炎病變。對(duì)每代連續(xù)返強(qiáng)試驗(yàn)接種的肺組織均可檢出豬肺炎支原體，第5代返強(qiáng)試驗(yàn)豬撲殺的分離物經(jīng)代謝抑制試驗(yàn)鑒定為豬肺炎支原體。連續(xù)5代返強(qiáng)試驗(yàn)的臨床癥狀和大體剖檢結(jié)果提示在5代次內(nèi)該疫苗菌株毒力穩(wěn)定，逐次傳遞沒有返強(qiáng)跡象。

3．2．2 菌株分離和鑒定 用該活疫苗(168株)肺內(nèi)注射后的肺臟懸液連續(xù)5次接種試驗(yàn)豬，逐次剖取各批次豬的肺臟接種于KM2培養(yǎng)基后均分離獲得的疑似豬肺炎支原體菌體，經(jīng)代謝抑制試驗(yàn)鑒定均與豬肺炎支原體J血清型一致，因豬肺炎支原體僅有一個(gè)血清型，所以分離到的菌株為豬肺炎支原體。再用豬肺炎支原體特異性P46引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均擴(kuò)增到了目的條帶。對(duì)豬支原體肺炎活疫苗(168株)的菌液和從第5次豬肺分離的豬肺炎支原體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，序列分析結(jié)果顯示兩者序列完全一致。

3．3 不同免疫劑量安全性試驗(yàn)

3批次豬支原體肺炎活疫苗(168株)進(jìn)行一次單劑量、單劑量重復(fù)和一次大劑量各接種5頭健康豬的安全性試驗(yàn)。另對(duì)照組5頭，各組在當(dāng)日注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～25 d的每日檢測(cè)直腸溫度，與對(duì)照組相比均未超過1℃(圖2～圖4)。注射后第1～25 d試驗(yàn)豬均表現(xiàn)正常，未觀察到呼吸困難、俯臥、嘔吐、食欲不振、震顫和死亡等臨床癥狀。在注射后25 d進(jìn)行剖檢，試驗(yàn)組注射部位有白色斑痕，無(wú)豬支原體肺炎病變，對(duì)照組未觀察到異常。

3．4 臨床安全性試驗(yàn)

5批次疫苗免疫后28 d內(nèi)臨床觀察，結(jié)果均表現(xiàn)正常，未見精神不振、食欲減退、呼吸困難、嘔吐、俯臥、震顫等不良癥狀。免疫組和對(duì)照組的豬在進(jìn)行抽樣檢測(cè)直腸體溫(圖5)，結(jié)果顯示免疫組豬的直腸溫度平均值與對(duì)照組的相差范圍在0．5℃以內(nèi)。

圖2 豬支原體肺炎活疫苗(168株)一次單劑量免疫豬的平均直腸體溫變化

4 討論與結(jié)論

疫苗免疫是防控豬支原體肺炎病的最有效措施之一。目前市面上的豬支原體肺炎疫苗有國(guó)產(chǎn)的活疫苗和進(jìn)口的滅活疫苗。其中滅活疫苗安全性和免疫效力均好，但其價(jià)格昂貴限制了廣泛使用;活疫苗安全性好，免疫效力高，價(jià)格低廉，在國(guó)內(nèi)正在替代滅活疫苗市場(chǎng)。而安全、有效和質(zhì)量可控是疫苗研究的核心，其中又以安全性最為重要。因此，我們對(duì)豬支原體肺炎活疫苗(168株)的安全性從不同代次、疫苗的不同劑量安全性和臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行了試驗(yàn)觀察。

5～15日齡是豬對(duì)豬肺炎支原體的易感期。同群感染性試驗(yàn)選用健康易感豬用高濃度的豬肺炎支原體(5×107CCU/mL)進(jìn)行感染，結(jié)果顯示免疫豬未觀察到豬支原體肺炎的臨床癥狀和大體病理變化，同時(shí)同群感染豬也未觀察到異常癥狀和變化。五代次連續(xù)感染試驗(yàn)證實(shí)豬肺炎支原體168株試驗(yàn)豬均未觀察到豬支原體肺炎的臨床癥狀和病理變化。這兩個(gè)試驗(yàn)證實(shí)制苗用菌株對(duì)豬安全，不會(huì)返強(qiáng)。大劑量和單劑量重復(fù)是對(duì)疫苗的又一嚴(yán)格的安全性評(píng)估，本研究中接種豬均未觀察到異常臨床表現(xiàn)，同時(shí)也未觀察到肺部病變。同時(shí)，還用疫苗進(jìn)行了臨床應(yīng)用結(jié)果也顯示疫苗安全。上述結(jié)果都說(shuō)明豬支原體肺炎活疫苗(168株)具有良好的安全性。

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