苯甲酸雌二醇對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶變化及雌激素的影響

張燕平

河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450000

慢性腦缺血或腦灌注不足伴發(fā)于腦動(dòng)脈粥樣硬化、血管性癡呆、Alzheimer病、Binswanger病等多種腦血管疾病的病理過(guò)程中，發(fā)病早期以認(rèn)知功能損害為主要表現(xiàn)，最終可能導(dǎo)致持久或進(jìn)展性認(rèn)知與神經(jīng)功能障礙［1］。有學(xué)者認(rèn)為，腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能障礙是慢性腦缺血患者記憶障礙和其他認(rèn)知功能障礙的原因之一［2］。而膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，CHAT）是 決 定 乙 酰 膽 堿 （acetylcholine，Ach）含量的關(guān)鍵因素，有關(guān)其在慢性腦缺血中的作用目前報(bào)道甚少。海馬CA1區(qū)是參與學(xué)習(xí)和記憶形成的重要部位，加之此區(qū)由于對(duì)稱性突觸多于γ－氨基丁酸（gama aminobutyric acid，GABA）突觸［3］。因此，腦組織遭受缺血后此區(qū)的神經(jīng)元更易損傷。有鑒于此，本研究在建立慢性腦缺血模型并應(yīng)用雌二醇進(jìn)行治療的基礎(chǔ)上觀測(cè)其行為學(xué)和海馬CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元的變化，進(jìn)一步推測(cè)該藥對(duì)慢性腦缺血大鼠可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量300～400g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。苯甲酸雌二醇、滅菌油溶液為上海通用藥業(yè)制藥廠產(chǎn)品；CHAT試劑盒為北京中杉公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立：30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血組和治療組，每組各10只。制作慢性腦缺血模型：10%水合氯醛（0.3mL／100g）腹腔注射麻醉，頸部備皮并消毒后，頸正中切開皮膚，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端與近心端后，從中間剪斷；假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余過(guò)程與手術(shù)組相同。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理：術(shù)后當(dāng)天給藥，治療組給予苯甲酸雌二醇腹腔內(nèi)注射（1mg／kg），每周2次；假手術(shù)組、缺血組給予苯甲酸雌二醇溶媒類似物——煮沸過(guò)的麻油。所有大鼠于術(shù)后飼養(yǎng)60d。

1.2.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試：術(shù)后60d采用Y型電迷宮法進(jìn)行主動(dòng)逃避學(xué)習(xí)能力測(cè)試［9］，大鼠認(rèn)知能力以達(dá)到連續(xù)10次測(cè)試中有9次（9／10）正確反應(yīng)時(shí)所需的電擊次數(shù)表示。術(shù)前及術(shù)后預(yù)測(cè)試1次，刪除靈活性過(guò)差的大鼠。

1.2.4 免疫組化染色：學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試后，大鼠麻醉，打開胸腔，暴露心臟，用250mL生理鹽水（37℃）經(jīng)心臟灌注快速?zèng)_洗去除血細(xì)胞，再用4%多聚甲醛250mL灌注固定，快速取腦，經(jīng)4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋后切片，片厚約4μm，免疫組化采用SP法。主要步驟為：①3%H2O2室溫孵育10min；②10%正常山羊血清封閉室溫孵育15min；③滴加一抗（CHAT，1：50）4℃ 過(guò)夜；④ 滴加生物素標(biāo)記的二抗（1：100）37℃ 孵育30min；⑤ 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的卵白素（1：100）37℃ 孵育30min；⑥D(zhuǎn)AB顯色；⑦PBS終止反應(yīng)。脫水，透明，封片，光鏡下觀察?？瞻讓?duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替CHAT一抗。

1.2.5 CHAT的測(cè)定：于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察CHAT免疫組織化學(xué)陽(yáng)性物質(zhì)的分布，同時(shí)采用德國(guó)Leica公司圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定海馬區(qū)陽(yáng)性物質(zhì)的光密度值（OD值），每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不連續(xù)視野，取其平均值，所有OD值測(cè)量均在相同的光學(xué)條件下完成。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，所有結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，用方差分析及兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1認(rèn)知能力測(cè)試結(jié)果見表1。缺血組和治療組學(xué)會(huì)主動(dòng)逃避所需的電擊次數(shù)較假手術(shù)組明顯增多（P＜0.01），表明認(rèn)知能力下降。治療組較缺血組認(rèn)知能力改善明顯（P＜0.01）。

2.2 CHAT免疫組化結(jié)果對(duì)照組海馬均有大量CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元和纖維分布。缺血組CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元和纖維顯著減少，分布稀疏，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。雌二醇治療組CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元和纖維明顯增多，與缺血組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表1 術(shù)后60d3組大鼠認(rèn)知能力測(cè)試結(jié)果 （s）

表1 術(shù)后60d3組大鼠認(rèn)知能力測(cè)試結(jié)果 （s）

與假手術(shù)組相比，＊P＜0.01；與缺血組比較，＊＊P＜0.01

組別 n 達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需電擊次數(shù)假手術(shù)組10 34.50±7.29缺血組 10 81.67±11.02＊治療組 10 59.33±11.33＊＊

表2 CHAT在各組鼠的表達(dá) （s）

表2 CHAT在各組鼠的表達(dá) （s）

與假手術(shù)組相比，＊P＜0.01；與缺血組比較，＊＊P＜0.01

組別 n 海馬CA1區(qū)假手術(shù)組10 76.3710±6.5142缺血組 10 48.2500±3.3126﹡治療組 10 75.7000±3.2111＊＊

3 討論

基底前腦富含膽堿能神經(jīng)元，該類神經(jīng)元發(fā)出投射纖維至皮質(zhì)、海馬，并在皮質(zhì)興奮、注意力集中及學(xué)習(xí)記憶中起重要作用。膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)記憶中作用逐步得到公認(rèn)。已有證據(jù)表明，海馬結(jié)構(gòu)是參與學(xué)習(xí)和記憶功能的重要部位，且與膽堿能系統(tǒng)直接相關(guān)［4］。同時(shí)，海馬也是大腦具有可塑性和極易受損的一個(gè)腦區(qū)，對(duì)缺血缺氧極為敏感。本實(shí)驗(yàn)采用持久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法造成大鼠腦組織缺血，經(jīng)行為學(xué)測(cè)試存在學(xué)習(xí)記憶障礙，是較理想的慢性腦缺血模型。

CHAT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成Ach過(guò)程中重要的酶，它在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成，是膽堿能神經(jīng)元的特殊標(biāo)志，故?？梢宰鳛檠芯磕憠A能神經(jīng)元的標(biāo)志或估計(jì)Ach含量的間接指標(biāo)［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)CHAT的活性明顯下降，同時(shí)出現(xiàn)行為學(xué)上的認(rèn)知障礙，說(shuō)明膽堿能系統(tǒng)在學(xué)習(xí)記憶中具有重要作用，而且說(shuō)明海馬CHAT的表達(dá)下降參與了慢性腦缺血的發(fā)生。

有證據(jù)表明雌激素水平低下，可直接影響神經(jīng)元的活性及修復(fù)，特別是在海馬、基底節(jié)、基底前腦和杏仁核，膽堿能神經(jīng)元減少，突觸數(shù)目降低，雌激素缺乏可加速神經(jīng)元缺失，影響軸突和樹突形成，同時(shí)影響多種神經(jīng)遞質(zhì)如Ach、5－HT、NE及NGF等，干擾正常的遞質(zhì)代謝和信息傳遞，也就是說(shuō)雌激素可以影響膽堿能系統(tǒng)和海馬，影響認(rèn)知功能。雌激素可能通過(guò)與NGF、BDNF及其受體的相互調(diào)節(jié)對(duì)膽堿能神經(jīng)元起營(yíng)養(yǎng)支持作用［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予雌激素治療后，CHAT活性明顯升高，大鼠認(rèn)知功能明顯改善，提示雌激素可能通過(guò)增加CHAT的活性來(lái)提高Ach含量，從而對(duì)記憶功能的維持起一定作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素在體給藥后，腦皮層厚度和海馬CA1區(qū)突觸數(shù)增加，并能促進(jìn)突觸體谷氨酸的釋放，促進(jìn)培養(yǎng)的皮層膽堿能神經(jīng)元發(fā)育，增強(qiáng)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性和蛋白質(zhì)含量，有利于Ach合成和易化突觸結(jié)構(gòu)的可塑性。其中雌激素同時(shí)增強(qiáng)膽堿能和谷氨酸能神經(jīng)元的活性可能是提高智能的關(guān)鍵［7］。Gibbs［8］認(rèn)為雌激素可能調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，改善膽堿能神經(jīng)元CHAT活性。我們的試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道相符，推測(cè)雌激素有可能通過(guò)直接的或?qū)ι窠?jīng)營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)節(jié)的間接作用，改善膽堿能神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)狀況，增強(qiáng)CHAT的活性。

綜上所述，雌激素通過(guò)其多靶點(diǎn)的藥理機(jī)制，提高了海馬神經(jīng)元CHAT的活性，改善了慢性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的膽堿能系統(tǒng)功能障礙，進(jìn)而提高了大鼠的學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)。

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