思密達對百草枯中毒大鼠多器官損傷的作用

王占青 馬玉英 尹彩星 衛(wèi)肖肖

【摘要】目的 探討思密達（smecta）對百草枯（paraquat，PQ）中毒大鼠血漿質量濃度的影響及對肺、胃、空腸損傷的防治作用，并分析其作用機制。方法 健康的ＳＤ大鼠76只隨機（隨機數(shù)字法）分為健康對照組（A組）6只、PQ(50 mg/kg)灌胃染毒組（B組）30只、思密達（400 mg/kg)干預組（C組）30只。B組、C組中毒后2、6、24、48、72 h分批處死存活的大鼠，每次6只，測定血漿PQ濃度，取肺、胃、空腸行ＨＥ 染色及病理學觀察并評分。數(shù)據(jù)通過正態(tài)分布和方差齊性檢驗，濃度比較采用兩樣本t檢驗；病理評分采用完全隨機設計單因素方差分析，并采用ＬＳＤ-t檢驗進行兩組之間比較；以P＜０.０５ 為差異具有統(tǒng)計學意義。結果 所有大鼠均無自然死亡，B組PQ血漿濃度(ng/ml)^{［（4320.6150±413.9471)，(440.3144±49.7762）］}；肺組織損傷逐漸加重，肺血管擴張充血，灶狀出血，肺間隔增厚、大量炎性細胞浸潤，局部肺實變；胃組織黏膜明充血，絨毛剝脫，炎癥細胞浸潤；空腸黏膜出血壞死，局部絨毛脫落，腺體減少，伴大量炎細胞。C組與B組在同一時間點相比，質量濃度明顯降低（P＜0.01）肺、胃、空腸病理變化均有不同程度減輕（P＜0.05，P＜0.05 或P＜0.01）。結論 思密達不僅降低血漿PQ質量濃度，而且減輕百草枯中毒大鼠的病理變化。

【關鍵詞】思密達；百草枯：血漿濃度；病理變化；治療作用

Therapeutic effects of smecta on multiorgans injury induced by paraquat in rats WANG Zhan-qing，MA Yu-ying, YIN Cai-xing,WEI Xiao-xiao.Department of Emergency, the Affiliated Hospital of Shihezi University, Shihezi 832002, China

【Abstract】Objective To evaluate therapeutic effect and the possible mechanism of smecta on paraquat plasma concentrations and multiorgans injury induced by paraquat intoxication in rats．Methods A total of 76 healthy adult SD rats were randomly(random number) divided into group A(control group n=6)，group B (poisoned group n=30 ) , group C (smecta-treated group n=30) . Rats in groups B and C were treated intragastrically with PQ at 50 mg/kg, the rats in the group C were given with smecta at 50 mg/kg, while the rats in the other two groups were only intragastrically adminstered with saline. Live rats in groups B and C were sacrificed at 2, 6, 24, 48, 72 h after administration of PQ for the determination of paraquat plasma concentrations and for HE staining of lung, stomach and jejunum. The rats were executed at the end of trial by the same way in group A. All measurement data were expressed as means ±standard deviation（x±s）.The data of pathological score were compared with Independent-samples T test and the data of PQ concentration compared with analysis of variance (ANOVA) followed by LSD-t multiple comparison test. P-values of less than 0.05 were considered statistically significant. Results The paraquat plasma concentration (ng/ml) was 440.314±49.776 to 4320.6150±413.947. There were different pathological changes of lung, stomach and jejunum in group B. Lung injuries gradually deteriorated, congestion, edema, leukocyte infiltration , incrassated septa and lung consolidation were observed. The pathological changes were obvious such as abruption of mucosa, hyperemic gastric mucosa and leukocyte infiltration in stomach. Haemorrhage of jejunum mucosa, abruption of villus, gland damage and inflammatory cell infiltration were found. Compared with group B, aIl the pathological changes mentioned above were obviously alleviated in group C（P＜0.05), and the concentrations reduced（P＜0.01）. Conclusions Smecta reduced paraquat plasma concentrations and alleviated pathologic injury of rats with PQ poisoning.

【Key words】Smecta; Paraquat; Plasma concentration; Pathological change; Therapeutic effect

百草枯（paraquat，PQ）作為除草劑在國內、外使用極為普遍，中毒事件頻發(fā)。大劑量激素和免疫抑制劑對PQ中毒治療有效，但因PQ中毒無特效治療，患者病死率仍居高不下^［1］。及時阻斷毒物吸收和清除已吸收毒物是治療QP中毒最根本的措施，積極尋找有效的治療方法，一直是國內、外研究的難點。PQ口服中毒10％～15％可經消化道吸收，0.5～2.0 h內血漿濃度達到峰值，主要通過腎臟排泄^［2］。思密達具有高效吸附能力和保護胃腸道作用，臨床應用廣泛。本研究旨在利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography ，HPLC)檢測大鼠血漿PQ質量濃度，并對胃、空腸、肺等組織進行觀察，探討思密達能否有效阻斷百草枯的吸收，尋求治療百草枯中毒的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

SPF級成年SD大鼠76只，購自新疆烏魯木齊市疾病防治和控制中心動物科，批號 SCXK（新）2003-0002，體質量200～250 g；20％百草枯水劑(江蘇南通先正達農藥公司) ；PQ標準品(HPLC)99.9area％，100 mg，美國SIGMA-ALDRICH ）；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、三乙胺（分析純）、磷酸（分析純）均購自天津光復試劑有限公司；庚烷磺酸鈉，分析純，purity≥98％，20 g (加拿大BBI)，編號S2068，上海生工生物工程公司提供；思密達（博福-益普生天津制藥有限公司生產）；HC-C18色譜柱（250μm×4.6μm×5 μm，美國，Agilent）；日本島津高效液相色譜儀（編號07007324；LC-20AT泵；CBM-20A控制器；SPD-M20A檢測器；SIL-20A自動進樣器；CTO-10AS VP 柱溫箱；CLASS-LC10工作站）；電子天平（SARTORIUS AG BP211D，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；LG16-W型臺式高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；XH-C渦旋器（金壇市國旺實驗儀器廠）

1.2 方法

1.2.1 動物分組、標本采集 實驗參照文獻^［3-4］進行。大鼠飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為生理鹽水對照組（A組）6只、染毒組（B組）30只、干預組（C組）30只。B、C組給予PQ(50 mg/kg)稀釋至1 ml灌胃染毒，A組同時給予1 ml生理鹽水灌胃。C組染毒后10 min給予思密達400 mg/kg（質量濃度60 mg/ml）灌胃，A組和B組同時等量生理鹽水灌胃。B組、C組分別于中毒后2、6、24、48、72 h處理存活的大鼠，每次6只。氯胺酮注射液150 ｍg/kg 腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血3 ml，5000 r/min離心5 min取血漿，-70 ℃凍存待測。打開胸腔、腹腔取左肺、胃、空腸，置于10％的甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，組織切片，HE染色及光學顯微鏡觀察并評分^［5-7］，A組于實驗結束后按同樣方法一并處理。

1.2.2 血漿百草枯含量檢測 精確稱取百草枯標準品10 mg于10 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，得質量濃度為1.0 mg/ml濃標液。濃標液儲存于4℃冰箱中，工作液在使用前由濃標液逐級稀釋制得。儀器分析條件：Agilent (HC-C18, 250 μm×4.6 μm×5 μm)色譜柱；流動相: 乙腈:75 mmol/L庚烷磺酸鈉(12∶ 88，V/V，用三乙胺調pH=3.0)；流速為1.0 ml/min；柱溫為室溫；檢測波長為258 nm。吸取血漿上清液0.5 ml置于試管中，加入體積分數(shù)為35％的高氯酸100 μl,蝸旋1 min。高速離心12 000 r/min,5 min，取上清液20 μl迸樣進行HPLC分析,記錄實驗數(shù)據(jù)。精確配制百草枯濃度為20、50、100、500、1000、5000 ng/ml范圍內的6個空白對照血漿樣品，在本色譜條件下，按樣品處理方法處理后，測其峰面積，由百草枯峰面積(y)對百草枯濃度(x)進行線性回歸。計算百草枯樣品的回歸方程，依據(jù)百草桔回歸方程可得血漿百草枯濃度(ng/ml)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示。數(shù)據(jù)通過正態(tài)分布和方差齊性檢驗，濃度比較采用兩樣本t檢驗；病理評分采用完全隨機設計單因素方差分析，并采用LSD-t檢驗進行兩組之間比較；以P＜０.０５ 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 百草枯線性關系及血漿百草桔含量

加入不同質量濃度PQ標準品的血漿和染毒大鼠血漿樣品的HPLC色譜圖見圖1～3。血漿百草枯回歸方程：

Y=98.8210x＋5707.5407

百草枯在20～5000 ng/ml范圍內線性關系良好，最低檢測限為20 ng/ml。B組血漿百草枯質量濃度隨時間延長而逐漸下降，2 h時點濃度最高，6 h仍保持較高水平，24 h后開始明顯下降，72 h時點質量濃度最低。C組在同一時間點與B組相比，血漿濃度明顯降低（P＜0.01）且下降的速度比B組快。見表1。

2.2 大鼠臟器組織病理觀察

2.2 .1 肺病理觀察 A組肺組織結構完整清晰，形態(tài)正常；B組肺組織損傷逐漸加重，中毒后2 h、6 h肺血管擴張、充血，肺泡間質有少量炎細胞；中毒后24 h充血加重，局部出現(xiàn)灶狀出血，肺間質炎癥細胞增多，肺間隔增厚。中毒后48 h肺泡結構明顯不完整，肺泡間質明顯增厚，可見大量中性粒細胞細胞、淋巴細胞，部分肺泡塌陷；中毒后72 h肺泡融合，小面積肺不張，肺實變明顯。C組肺組織有不同程度的充血，水腫、炎癥細胞浸潤、肺泡間質增厚，但較B組輕，未見肺不張和肺大泡，見圖4。B、C組各個時間點肺組織病理評分與A組比較均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;C組中毒后6、24、48、72 h與B組同一時間點相比病理評分差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）表2。

2.2 .2 胃、空腸病理觀察 A組胃各層組織完整，未見明顯病理改變。B組胃組織結構破壞明顯，中毒后2、6 h損傷最為嚴重，黏膜明顯糜爛出血，間質血管充血明顯，上皮不完整，絨毛剝脫，腺體數(shù)目減少，炎癥細胞浸潤。中毒后24、48、72 h胃組織逐漸修復，以輕度的胃黏膜萎縮，炎癥細胞浸潤為主。C組與B組在同一時間點相比胃組織結構損傷明顯減輕，可見局部黏膜脫落和炎細胞數(shù)浸潤，見圖5。B、C組各個時間點胃組織病理評分與A組比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）; C組中毒后2、6、24 h與B組同一時間點相比病理評分有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。A組空腸結構完整未見變化。B組2、6 h大鼠空腸黏膜出血壞死，局部絨毛脫落，腸壁有少量中性粒細胞浸潤；24 h腸黏膜灶狀壞死、溶解，腺體減少，伴大量炎細胞，殘存腺體萎縮、破壞。48、72 h黏膜損傷有所減輕，但可見小部分絨毛脫落，輕度血管擴張，散在中性粒細胞浸潤。C組大鼠與B組相比，空腸變化不明顯，結構較完整，偶見絨毛脫落，點狀出血，固有層中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，見圖6。B、C組各個時間點空腸病理評分與A組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）; C組中毒后6、24、48、72 h與B組同一時間點相比空腸病理評分差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）見表2。

3 討論

百草枯中毒常導致機體發(fā)生以肺損傷為主的多器官功能障礙而死亡^［8-10］。血漿百草枯質量濃度^［11］和接受治療的時間^［12］是決定患者預后的因素。及時阻斷毒物吸收，降低血漿百草枯濃度，減少多器官損傷是提高患者生存率的基本措施。臨床多主張早期應用白陶土、活性炭來吸附或降解胃內的百草枯，而關于使用思密達灌胃治療百草枯中毒的研究少見報道。

百草枯在大鼠體內的代謝動力學尚不十分清楚。本實驗顯示，染毒組、思密達干預組大鼠染毒后2 h血漿濃度最高，72 h濃度最低，但仍未消失，與既往報道不同，可能與給藥劑量、途徑及實驗客觀條件不同有關。同一時間點相比，干預組大鼠血漿濃度比染毒組明顯降低。其可能機制如下：（1）思密達具有層狀結構及非均勻性電荷分布，主要成分為八面體蒙脫石微粒，其粉末粒度達1～3 μm，表面積大。中毒后及時給予大鼠思密達灌胃，使其與百草枯在胃內充分接觸、混合，高效地吸附了胃腸道內毒物，降低血漿PQ質量濃度。姜家明等^［13］顯示思密達比白陶土和活性炭有更強的吸附能力，對救治百草枯中毒更有力。（2）思密達與百草枯的結合不可逆轉，而且結合物不進入血液循環(huán)，直接經消化道排出體外，保證了思密達吸附毒物的有效性。（3）思密達能夠減少農藥中毒所致機體胃腸功能不全的發(fā)生率，恢復胃腸蠕動，縮短毒物在消化道的停留時間^［14］，徹底清除腸道內殘毒，避免再吸收。

百草枯通過化學腐蝕、脂質過氧化損傷、炎癥細胞的激活、一氧化氮合成酶的過度表達^［15］等環(huán)節(jié)對機體造成損傷。從大鼠HE染色結果可以看到，肺、空腸損傷較重，胃較輕。染毒組肺組織病理變化呈進行性發(fā)展，由肺水腫、炎癥細胞浸潤，血管擴張轉變成肺間隔增厚，肺泡融合或肺實變；胃組織中毒24 h內黏膜明顯糜爛出血，上皮不完整，腺體數(shù)目減少，24 h后胃組織逐漸修復；空腸中毒后24 h、48 h病理改變最典型，可以觀察到片狀絨毛壞死、溶解，大量炎細胞，腺體破壞^［16］。干預組肺、胃、空腸病理損傷均比染毒組減輕。結果證明思密達對百草枯中毒大鼠多器官病理損傷有積極的保護作用,其可能機制為：（1）思密達降低了血漿百草枯質量濃度，繼而減輕了百草枯在機體內所導致的鏈式損傷過程。（2）思密達對消化道黏膜具有很強的覆蓋能力和屏障作用，能和粘液蛋白結合，有助于消化道上皮組織再生修復。（3）思密達激活凝血因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅻ，具有消化道局部止血作用。（4）思密達有效地固定、抑制消化道內病毒、病菌及其產生的毒素，減輕炎癥反應^［17］。

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（收稿日期：2012-04-04）

（本文編輯：何小軍 ）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.08.006

作者單位:832003 新疆維吾爾族自治區(qū)石河子，石河子大學附屬醫(yī)院急診科

通信作者:馬玉英，Email:jznkmyy@sina.com

中華急診醫(yī)學雜志2012年8月第21卷第8期Chin J Emerg Med,August 2012,Vol.21,No.8

P825-829