離體SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)酸化對早老素－1表達(dá)的影響＊

高芳峭，方伯言

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，遼寧錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 121001）

阿爾茨海默病（alzheimer′s disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。主要病理改變是在大腦中于記憶和認(rèn)知相關(guān)區(qū)域出現(xiàn)β淀粉樣蛋白（amyloid proteinβ，Aβ）聚合產(chǎn)生的纖維沉積形成老年斑并引起神經(jīng)受損等一系列相關(guān)的病理改變［1］。Aβ是由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）分別通過β－分泌酶和γ－分泌酶作用后生成［2］。過去對β－分泌酶研究的比較清楚，但對γ－分泌酶的結(jié)構(gòu)與特性卻一直不甚清楚。近年來一些研究提示早老素－1（Presenilin 1，PS1）是γ－分泌酶水解APP所必須的，起到重要的催化作用，甚至可以說PS1就是未知的γ－分泌酶［3－5］。AD中神經(jīng)細(xì)胞死亡是由細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的，由于各種物理和化學(xué)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡都出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酸化，推斷AD的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的同時也伴有細(xì)胞內(nèi)酸化。有研究表明這些酶在酸性條件下具有較高的活性，但相關(guān)的研究和證據(jù)還比較少。酸堿調(diào)節(jié)基因－胞膜離子交換蛋白Na＋－H＋交換泵（Na＋－H＋exchanger，NHE）基因在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮重要作用［7］，因此作者應(yīng)用pAd－miR－NHE1腺病毒顆粒感染SH－SY5Y細(xì)胞，抑制細(xì)胞表面酸堿調(diào)節(jié)基因NHE1的表達(dá)［8］，使細(xì)胞內(nèi)pH值降低，另外降低細(xì)胞培養(yǎng)基pH值，同樣降低細(xì)胞內(nèi)pH值，觀察分析PS1在pH值降低的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，進(jìn)一步了解細(xì)胞內(nèi)pH值對PS1功能和活性的影響，探討AD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與miRNA腺病毒轉(zhuǎn)染SH－SY5Y細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH－SY5Y細(xì)胞（中國醫(yī)科大學(xué)贈），采用10%的FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基（GIBCO），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。對腺病毒pAd－miR－NHE1和pAd－miR－NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行鑒定后［8］，分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為NHE1基因抑制組（NHE1組）和陰性對照組（NC組）。將用正常培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)的SH－SY5Y細(xì)胞按106細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，當(dāng)達(dá)到80%～90%融合時按MOI值為160進(jìn)行轉(zhuǎn)染（細(xì)胞的感染率在90%左右為最佳 MOI值），將準(zhǔn)備好的腺病毒與無血清無抗體的培養(yǎng)基按一定比例混合（取50μL腺病毒和2 950μL無血清無抗生素的培養(yǎng)基），混勻，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附1h后，PBS洗滌后改用2%血清雙抗培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48h后收集細(xì)胞。

1.2 酸化細(xì)胞外環(huán)境，選出最適細(xì)胞生長的酸性培養(yǎng)基 降低細(xì)胞培養(yǎng)基pH值，以pH值6.8為基準(zhǔn)，依次降低0.5形成5個梯度pH值的培養(yǎng)基，從接種開始每12小時計(jì)數(shù)1次，至72h，共6個時間點(diǎn)。細(xì)胞系以平均1×104個細(xì)胞密度接種于在24孔細(xì)胞板上，各梯度每個時間點(diǎn)重復(fù)3個孔；接種后12h開始用0.25%胰蛋白酶消化每個梯度的第1組，制成1 mL細(xì)胞懸液，進(jìn)行計(jì)數(shù)，取3個孔的平均值，至72h結(jié)束，通過光鏡觀察細(xì)胞生長，根據(jù)測得的數(shù)值，繪制生長曲線，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線分析，確定最適細(xì)胞生長的酸性培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞內(nèi)pH值測定 用緩沖液求標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作高鉀緩沖液，將高鉀緩沖液分裝6只試管中，每只5mL，分別將pH值調(diào)至不同的值，分別為4.8、5.3、5.8、6.3、6.8、7.3，6只試管中分別加入Nigericine和BCECF，濃度分別為30μmol／L和0.25μmol／L，取正常SH－SY5Y細(xì)胞胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗2次，分別加入相同的細(xì)胞與上述試管中，37℃孵育12min，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)記錄490nm／440nm熒光強(qiáng)度比值（FIR），求出pH值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各組細(xì)胞胰酶消化，1 000r／min離心5min，棄上清液，生理鹽水洗1次，BCECF／AM／DMSO濃度為2mg／mL加入培養(yǎng)基中，37℃孵育細(xì)胞12min，用熒光分光光度計(jì)記錄490nm／440nm熒光強(qiáng)度比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出細(xì)胞內(nèi)pH值。

1.4 ELISA法定量分析細(xì)胞內(nèi)的PS1 各條件下的細(xì)胞系以2×106個細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，分別培養(yǎng)48h，貼壁細(xì)胞用冷PBS洗2次，用預(yù)冷的RIPA裂解液50mmol／L，刮下細(xì)胞，冰上裂解30min，將裂解產(chǎn)物以14 000r／min離心5min收集上清液，裂解液中PS1的含量用ELISA試劑盒（RD）測量，所有操作按試劑盒說明書進(jìn)行，每組樣品做3個復(fù)孔。

1.5 Western Blotting 取各條件下穩(wěn)定表達(dá)PS1的貼壁細(xì)胞用冷PBS洗1次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，刮下細(xì)胞，在冰上裂解30min，將裂解物離心收集上清液。蛋白20μg／孔上樣于10%SDS－PAGE，每組樣品重復(fù)兩個孔，電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，分別與一抗兔抗PS1單克隆抗體（Bioworld Technology，USA）（1∶800），兔抗β－actin單克隆抗體（碧云天公司）（1∶500）孵育4℃過夜。二抗用辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig（碧云天公司）（1∶500）孵育1h，加入適量的BCIP／NBT（碧云天公司）染色液顯色。

2 結(jié) 果

2.1 選出適合細(xì)胞生長的酸性培養(yǎng)基 當(dāng)pH值為6.3時SH－SY5Y細(xì)胞很快貼壁，接種后24h內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖速度不甚活躍，大約36h開始，倒置顯微鏡下可以觀察到貼壁細(xì)胞增殖迅速，48～72h這些細(xì)胞增殖進(jìn)一步擴(kuò)大，鋪滿瓶底，鏡下細(xì)胞呈多角形。當(dāng)pH值為6.8或5.8時，情況類似，僅增值速度稍慢，于72h后細(xì)胞數(shù)約為前者的50%。當(dāng)pH值為5.3時，細(xì)胞卻貼壁不牢，部分懸浮，12h觀察細(xì)胞數(shù)減為接種時的一半，以后細(xì)胞數(shù)量不增加或稍增加后隨即停止，形態(tài)極不規(guī)則。當(dāng)pH值為4.8時，12h觀察鏡下細(xì)胞成為圓球形懸浮細(xì)胞，飄蕩在培養(yǎng)液中，大部分細(xì)胞死亡。通過觀察，適合細(xì)胞生長的酸性培養(yǎng)基pH值為6.3。

2.2 細(xì)胞內(nèi)pH值降低的SH－SY5Y細(xì)胞模型建立 根據(jù)熒光分光光度計(jì)測得的緩沖液490nm／440nm熒光強(qiáng)度比值，計(jì)算出pH值標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為Y＝0.464 1 X＋4.088 7（r＝0.94），再根據(jù)各組細(xì)胞的490nm／440nm熒光強(qiáng)度比值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)pH值（表1）。正常對照組細(xì)胞內(nèi)pH值為7.27±0.02，而NHE1組和酸化培養(yǎng)基組細(xì)胞內(nèi)pH值分別為6.62±0.02和6.99±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NHE1組和酸化培養(yǎng)基組細(xì)胞內(nèi)pH值明顯降低，說明模型成功建立，正常對照組和NC組細(xì)胞相比細(xì)胞pH值無明顯差別。

表1 各組細(xì)胞內(nèi)pH值情況

2.3 PS1含量測定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為Y＝0.001 X＋0.419（r＝0.87），再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度（表2）。從結(jié)果中可以看出，細(xì)胞內(nèi)PS1的含量受細(xì)胞內(nèi)pH值影響：正常對照組和NC組胞漿內(nèi)PS1含量表達(dá)較低，NHE1組和酸化培養(yǎng)基組細(xì)胞內(nèi)PS1含量均較正常對照組和NC組明顯增多，但NHE1組與酸化培養(yǎng)基組細(xì)胞內(nèi)PS1含量變化無明顯差異（P＞0.05），正常對照組與NC組細(xì)胞內(nèi)PS1含量變化無明顯差異（P＞0.05）。此結(jié)果表明，PS1含量與細(xì)胞內(nèi)pH值呈依賴關(guān)系，SH－SY5Y細(xì)胞內(nèi)pH值降低可使胞漿內(nèi)PS1生成量增加。

表2 ELISA法檢測各組細(xì)胞內(nèi)PS1蛋白濃度值

2.4 PS1的表達(dá) 利用抗PS1單克隆抗體進(jìn)行Western Blotting檢測各組細(xì)胞內(nèi)PS1的表達(dá)，可識別相對分子質(zhì)量大約為60×103的PS1。在所檢測的4組中，PS1都可顯現(xiàn)（圖1），前兩組的條帶很模糊，可能由于蛋白含量較少的緣故，后兩組條帶清晰顯現(xiàn)。后兩組細(xì)胞內(nèi)PS1表達(dá)量與前兩組細(xì)胞比較統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異，正常細(xì)胞組和NC組PS1表達(dá)量無明顯差異（P＞0.05），NHE1組與酸化培養(yǎng)基組細(xì)胞內(nèi)PS1表達(dá)量無明顯差異（P＞0.05），結(jié)果顯示與ELISA結(jié)果相一致。見表3。

圖1 PS1的Western Blotting檢測

表3 Western Bloig檢測各組細(xì)胞PS1蛋白表達(dá)凈OD值

3 討 論

隨著人口老齡化，老年期癡呆越來越引起人們的關(guān)注。現(xiàn)在雖然認(rèn)識到AD的發(fā)病機(jī)制是由于患者體內(nèi)產(chǎn)生過多Aβ并在大腦中形成纖維沉積所致，但對Aβ如何過多產(chǎn)生的機(jī)制還并不清楚。β－分泌酶和γ－分泌酶的活性異?？赡苁菍?dǎo)致Aβ增多的原因。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為與AD中神經(jīng)元細(xì)胞退化過程中幾個階段有關(guān)，所以有些研究者認(rèn)為AD中神經(jīng)元細(xì)胞死亡是由細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的。細(xì)胞內(nèi)酸化作為細(xì)胞凋亡的一個重要特征已被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用各種外源性的物理和化學(xué)刺激誘導(dǎo)各種不同的細(xì)胞凋亡的同時都伴有出現(xiàn)細(xì)胞漿的酸化。也就是說AD的神經(jīng)細(xì)胞呈細(xì)胞內(nèi)酸化狀態(tài)。

細(xì)胞內(nèi)pH值是反映內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的一項(xiàng)指標(biāo)，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝中起重要作用。體內(nèi)眾多的酶類同樣受到最基本的化學(xué)調(diào)節(jié)—pH值的調(diào)節(jié)，pH值直接影響到酶的活性、表達(dá)及構(gòu)象。這使作者產(chǎn)生一個設(shè)想，細(xì)胞內(nèi)pH值的變化可能對APP裂解—γ－分泌酶的功能產(chǎn)生影響，即細(xì)胞內(nèi)pH值降低使γ－分泌酶裂解APP生成Aβ的活性增高。

γ－分泌酶是一個包含早老素在內(nèi)的蛋白復(fù)合體，這是Aβ產(chǎn)生所必須的一個酶。PS包括PS1和PS2，PS1廣泛分布于人的腦和外周組織，PS2則主要表達(dá)于人的心肌、骨骼肌等外周組織，對AD的作用不大［9－10］。因此，在本實(shí)驗(yàn)中選擇的指標(biāo)只包括了PS1，而不包括對AD作用不大的PS2?，F(xiàn)在有越來越多的研究顯示PS1可能就是預(yù)期的γ－分泌酶，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［11］，敲除編碼PS1基因的小鼠γ－分泌酶的活性降低80%，Aβ含量大大降低，PS1和PS2基因雙敲除的小鼠，其γ－分泌酶活性完全被抑制，這些均表明PS1是γ－分泌酶水解APP所必須的，因此PS1是γ－分泌酶的主要組成部分，起到重要的催化作用，是γ－分泌酶活性基團(tuán)。本研究通過建立細(xì)胞內(nèi)酸化的SH－SY5Y細(xì)胞模型，探討γ分泌酶主要成分PS1在胞漿pH值降低的細(xì)胞中的表達(dá)及其活性是否增高，進(jìn)而分析細(xì)胞內(nèi)pH值變化與γ－分泌酶活性的關(guān)系。

結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)pH值降低對PS1的表達(dá)及活性有一定影響作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常SH－SY5Y細(xì)胞相比，NHE1受抑制的細(xì)胞和用酸性培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的胞漿內(nèi)PS1含量及蛋白表達(dá)均顯著增高，而NHE1未被抑制的NC組細(xì)胞的胞漿內(nèi)PS1含量及蛋白表達(dá)則無顯著變化，與預(yù)期的二者之間變化關(guān)系是一致的。

從本研究看，細(xì)胞內(nèi)pH值降低的細(xì)胞胞漿內(nèi)PS1濃度及蛋白表達(dá)是增加的，說明PS1的活性在酸化細(xì)胞中是明顯升高的，據(jù)此推測，細(xì)胞內(nèi)pH值降低使γ－分泌酶的活性升高，在AD患者腦內(nèi)γ－分泌酶的活性也是如此。因?yàn)棣茫置诿富钚陨咴贏D發(fā)生中具有關(guān)鍵性的作用，所以作者認(rèn)為γ－分泌酶含量和蛋白水平的升高可能是高齡人群易發(fā)AD的一個關(guān)鍵性的生物學(xué)因素。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持了AD中γ－分泌酶的活性異常是導(dǎo)致Aβ增多的原因之一。

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