應(yīng)用膠體金免疫層析法測(cè)定牛奶中的磺胺類藥物殘留

李海龍 （北京市昌平區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 102200）

萬(wàn)宇平* 馮才茂 孫 震 崔廷婷 （北京勤邦生物技術(shù)有限公司）

磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)是具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，現(xiàn)廣泛用于預(yù)防和治療乳牛傳染病[1]，并有飼料生產(chǎn)企業(yè)將其作為飼料添加劑，以預(yù)防病毒性疾病的發(fā)生，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)奶牛的生長(zhǎng)及生產(chǎn)性能[2]。但不合理的使用容易造成藥物在牛奶中的殘留，并對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，如引起過(guò)敏反應(yīng)、增加細(xì)菌耐藥性等[3,4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告中已規(guī)定牛奶中總磺胺以及單個(gè)磺胺藥物的最高殘留限量(MRL)為100μg/kg，磺胺二甲嘧啶的MRL為25μg/kg[5]，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的磺胺類藥物殘留檢測(cè)技術(shù)非常必要。

膠體金免疫層析技術(shù)(Gold immunochromatographic assay，GICA)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一項(xiàng)免疫標(biāo)記技術(shù)，它以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)、大孔徑微孔濾膜為載體、膠體金為固相標(biāo)記物來(lái)定性檢測(cè)樣本中的待測(cè)物質(zhì)[6]。因其快速、便捷，因此繼抗生素微生物檢測(cè)法[7,8]、理化分析法(高效液相色譜法[1,9]、液質(zhì)聯(lián)用法[10,11]、氣相色譜法[12]、分光光度法[13]等)和免疫測(cè)定法(酶聯(lián)免疫法[14]、放射免疫法[15]等)后，GICA分析法逐漸被廣泛應(yīng)用于牛奶中抗生素殘留檢測(cè)中[6,16,17]。本試驗(yàn)利用膠體金免疫層析法對(duì)牛奶中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，為磺胺類藥物的殘留監(jiān)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）市售牛奶、磺胺類藥物快速檢測(cè)試紙(北京勤邦生物技術(shù)有限公司)其中包括微孔試劑和試紙條、磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)純度≥99%。（2）微量移液器(單道20～200μl、100～1000μl、多道50～300μl美國(guó)Thermo公司)、Acquity液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源(美國(guó)Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 使用前將待檢奶樣恢復(fù)至室溫。(注：牛奶樣品必須為均勻液體，不能有結(jié)塊、發(fā)酸和沉淀)。

1.2.2 檢測(cè)步驟 將原包裝預(yù)先平衡至室溫，打開后取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記；用微量移液器吸取200μl待檢牛奶樣品溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；將標(biāo)記好的試紙條插入微孔中印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中；室溫(20～25℃)孵育5min后，取出試紙條，判定結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判斷 陰性(-)：C線和T線都顯色，無(wú)論顏色深淺，均表示牛奶樣品中磺胺類藥物濃度低于檢測(cè)限。陽(yáng)性(+)：C線顯色，T線不顯色，表示牛奶樣品中磺胺類藥物濃度高于或等于檢測(cè)限。無(wú)效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過(guò)程或試紙條已變質(zhì)失效。在此情況下，應(yīng)用新的試紙重新測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度試驗(yàn)

采用樣品前處理方法，在空白樣品中分別添加磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品至一定的終濃度，然后取三批試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每批測(cè)定5個(gè)重復(fù)，結(jié)果見表1，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由表1可知，磺胺類藥物快速檢測(cè)試紙條測(cè)定牛奶中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)限分別為：磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯噠嗪30μg/L、磺胺間二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺間甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺對(duì)甲氧嘧啶30μg/L、磺胺異噁唑10μg/L、磺胺甲氧噠嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L。

表1 靈敏度試驗(yàn) (mg/L)

圖1 試紙條檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 假陽(yáng)性率試驗(yàn)

用3個(gè)批次的磺胺類藥物膠體金試紙條對(duì)50份陰性牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。該50份陰性牛奶樣品中有1份為陽(yáng)性，其余全為陰性，假陽(yáng)性率為2%。

2.3 假陰性率試驗(yàn)

用3個(gè)批次的磺胺類藥物膠體金試紙條對(duì)50份分別添加磺胺嘧啶至濃度60μg/L，磺胺二甲基嘧啶至濃度20μg/L，磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑至濃度80μg/L，磺胺氯噠嗪、磺胺對(duì)甲氧嘧啶至濃度30μg/L，磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺苯酰至濃度50μg/L，磺胺異噁唑至濃度10μg/L、磺胺甲氧噠嗪、磺胺多辛至濃度70μg/L的陽(yáng)性牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。該50份陽(yáng)性牛奶樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，假陰性率為0。

2.4 特異性試驗(yàn)

將恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素溶于pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，配成濃度為500μg/L的溶液，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C線和T線均顯色，顯示陰性結(jié)果，表明本試紙條對(duì)其他抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。

表2 假陽(yáng)性率、假陰性率試驗(yàn)

2.5 與儀器方法比較

隨機(jī)抽取50份牛奶樣本，用試紙條方法和國(guó)標(biāo)方法《GB/T 21316—2007 動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》分別進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果篩選出3份陽(yáng)性樣本，試紙條結(jié)果均為C線顯示出紅色條帶，T線不顯色；儀器結(jié)果分別為105.2μg/L、180.7μg/L和110.3μg/L。可見，GICA法和LC-MS/MS法測(cè)定結(jié)果基本一致，符合度達(dá)到100%，適用于牛奶樣本中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究采用膠體金免疫層析法對(duì)牛奶中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限分別為磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯噠嗪30μg/L、磺胺間二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺間甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺對(duì)甲氧嘧啶30μg/L、磺胺異噁唑10μg/L、磺胺甲氧噠嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L，檢測(cè)陰、陽(yáng)性樣本時(shí)，假陽(yáng)性率為2%，假陰性率為0；對(duì)其他抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，特異性較好；與液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法相比，檢測(cè)結(jié)果一致，符合度達(dá)到100%。

本研究所使用的膠體金試紙條是在傳統(tǒng)的試紙條基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。將膠體金標(biāo)記的抗體直接凍干在微孔試劑中，在檢測(cè)過(guò)程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個(gè)體系的反應(yīng)靈敏度，易于對(duì)樣品中的藥物殘留情況進(jìn)行分析；同時(shí)，擯棄了傳統(tǒng)試紙條的塑料卡殼，僅以“裸條”形式裝于試劑桶中，節(jié)約空間，減少生產(chǎn)和運(yùn)輸成本。盡管結(jié)構(gòu)的改進(jìn)提高了試紙條的靈敏度，但由于通過(guò)顏色判斷結(jié)果比較主觀，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題，因此對(duì)于陽(yáng)性樣本，還需要用LC-MS/MS等儀器方法進(jìn)行確證。

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