8味中藥對奶牛乳房炎病原菌的體外抑菌試驗

郭 慶，朱 偉，易 瓊，何炳坤，徐賓朋，王 魯

（1．貴州大學(xué)貴州省生化工程中心，貴州 貴陽550025；2．安徽科寶生物工程有限公司，安徽 淮北235025；3．貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；4．北京生泰爾生物科技有限公司，北京 昌平102206）

奶牛乳房炎是由各種病因引起的乳房炎癥，該病從發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有150多年的歷史，給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。致病因素中細菌感染的乳房炎占大多數(shù)，主要病原菌包括金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌等［1－3］。本省奶牛乳房炎的主要致病菌為金黃色葡萄球菌和鏈球菌，所占比例為81．79%［4］。目前，雖已有許多措施用于此病的防治，大多用抗生素、激素和化學(xué)合成藥等防治奶牛乳房炎，由于長期使用耐藥菌株增加，內(nèi)分泌功能紊亂，抗生素殘留和獸藥殘留超標等問題，給畜產(chǎn)品及公共衛(wèi)生帶來危害［5－6］。中草藥是純天然物質(zhì)，具有抗菌、消炎、低毒和細菌不易產(chǎn)生耐藥性等特點，應(yīng)用中草藥替代抗生素防治奶牛乳腺炎，已日益為國內(nèi)外學(xué)者所認識。本試驗采用試管二倍稀釋法，比較8味中藥對3種主要致病菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度，旨在篩選出效果最好的中藥，為研制治療奶牛乳房炎方劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 中藥 金銀花、蒲公英、連翹、芙蓉花、瓜蔞、大黃、黃芪、當(dāng)歸均為生藥，購于貴陽市云巖區(qū)頭橋中藥店，經(jīng)貴州大學(xué)中藥實驗室鑒定。

1．2 試驗菌株 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌，均由貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室自貴陽某奶牛場患有隱性乳房炎牛奶中分離、鑒定提供。

1．3 儀器 HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋；DL－360B智能超聲波；微量移液器；LD4－2低速離心機；LDZX－50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器；RE－52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；HH－B11－500型電熱恒溫培養(yǎng)箱；SW－CJ－1F單人雙面凈化工作臺。

1．4 試劑及培養(yǎng)基 牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨，購自貴州賽蘭博生物科技有限公司；石油醚、酒精等均為分析純；普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基，參照文獻［7］制備。

1．5 中藥液制備 將金銀花、蒲公英、連翹等分別準確稱取100g，用70%乙醇浸泡30min（料液比10∶1），然后超聲15min，回流提取第1次2h，用16層紗布過濾倒出藥液。藥渣再加70%乙醇（料液比8∶1），第2次1h，倒出藥液，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，加入石油醚萃取，水相濃縮至1 g／mL，3 000r／min離心10min，取上清液，121℃流通蒸汽滅菌15min。滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．6 試驗菌株的準備 將試驗菌株復(fù)壯、活化后接種普通肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18～24h，比濁管比濁至0．5個麥氏比濁管（1%BaCl20．5mL，1%H2SO499．5mL），即將菌液配成1．5×108CFU／mL，備用。

1．7 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度的測定（MBC）試驗 采用試管二倍稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC）：操作全部在超凈工作臺內(nèi)進行。（1）取加塞無菌小試管9支，每管中加入制好的普通肉湯培養(yǎng)基1mL，在第1管加中藥1mL，用微量移液器混勻，吸取1mL至第2管混勻，依次到第7管，第8管做陽性對照（加菌液不加中藥），第9管做陰性對照（加中藥不加菌液）。（2）加稀釋好的菌液0．1 mL，第9管不加菌液。此時1號到7號管內(nèi)藥液的濃度分別相當(dāng)于500mg／mL、250mg／mL、125mg／m、62．5mg／mL、31．25mg／mL、15．63mg／mL、7．81mg／mL生藥濃度，8號管作陽性對照管，9號管作陰性對照管。（3）將各組試管置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，觀察記錄結(jié)果。與對照組比較，有絮狀沉淀的管則為有細菌生長，無絮狀沉淀的管為細菌生長受抑制管，以肉眼觀察無絮狀沉淀管的最低藥物濃度作為該藥的最低抑菌濃度（MIC）。（4）重復(fù)1至3步，試驗結(jié)果取3次的平均值。（5）結(jié)果的判斷標準：由于中草藥對細菌的MIC國內(nèi)目前尚無統(tǒng)一的標準，本試驗參照同類試驗［8］的標準作為判斷標準。即當(dāng)MIC＜7．81mg／mL生藥濃度時為高度敏感；當(dāng) MIC在15．63～62．5mg／mL生藥濃度時為中度敏感；當(dāng) MIC為62．5～250．00mg／mL生藥濃度時為較敏感；當(dāng)MIC＞250．00mg／mL生藥濃度時為不敏感。測出最低抑菌濃度（MIC）后，再依次從未見細菌生長的各試管培養(yǎng)物中取一接種環(huán)，接種于不含藥的普通瓊脂平板上，輕輕攤開菌液，37℃培養(yǎng)24h，觀察有無細菌生長。普通瓊脂平板中，生長的菌落數(shù)小于5個菌落的藥液最低濃度，即為最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果

8味中藥對3種致病菌的體外最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定結(jié)果見表1。

表1 中藥對3種致病菌的MIC和MBC （mg／mL）

從表1中可以看出，金黃色葡萄球菌對金銀花、蒲公英、連翹、大黃中度敏感；芙蓉花、黃芪次之；大腸桿菌對芙蓉花中度敏感；金銀花、蒲公英次之；無乳鏈球菌對芙蓉花中度敏感；除黃芪不敏感其余為較敏感。

3 討論

3．1 本試驗所用菌株直接從患病奶牛乳中分離并鑒定，用中草藥提取物對3種細菌的抗菌活性進行測定，其結(jié)果更有說服力。從本次試驗結(jié)果可知，中草藥對這3種細菌的抗菌活性與文獻報道［9－11］相一致。中藥的產(chǎn)地，不同細菌分離菌株和毒力是影響中藥體外抑菌試驗結(jié)果的重要因素。

3．2 本試驗采用乙醇回流提取法提取藥液來測定其抑菌效果，效果最好的芙蓉花對3種致病菌體外最低抑菌濃度分別為 62．50mg／mL、31．25mg／mL、15．63mg／mL。金銀花、連翹對金黃色葡萄球菌體外抑菌效果最好，濃度均為15．63mg／mL。從本次試驗結(jié)果可知，芙蓉花、金銀花、連翹可作為防治奶牛乳腺炎制劑的主藥，但與其他藥物之間的配伍作用及其體外藥理作用還需要進一步研究。

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