IAC-HPLC熒光檢測法測定飼料中的玉米赤霉烯酮方法研究

饒正華 李 蘭

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所

[國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（北京）]，北京 100081)

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種具強(qiáng)烈致畸作用的生殖系統(tǒng)霉菌毒素，我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了配合飼料和玉米的允許量≤0.5 mg/kg，但我國現(xiàn)有的ZEN檢測標(biāo)準(zhǔn)中使用的薄層色譜法為半定量法，酶聯(lián)免疫吸附法為篩選法，兩種方法都不是準(zhǔn)確定量法，因此，建立準(zhǔn)確高效的檢測方法對于檢測和控制飼料中玉米赤霉烯酮含量具有重要意義。

免疫親和柱（IAC）由于其高選擇性、高靈敏度、凈化效果好、易操作的特點(diǎn)而被普遍用于霉菌毒素的檢測。國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 17372:2008采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法對飼料中玉米赤霉烯酮進(jìn)行檢測，類似技術(shù)路線在檢測大豆、油菜籽、植物油等中的玉米赤霉烯酮時也廣泛使用。本研究旨在建立飼料中玉米赤霉烯酮的IAC-HPLC熒光檢測法。

1 材料與方法

1.1 儀器

振蕩器、氮吹儀、高速均質(zhì)器、高效液相色譜儀（配有熒光檢測器）；色譜柱：C18柱，長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm；真空裝置或空氣壓力泵；玻璃微纖維濾紙（直徑 11 cm、孔徑 1.5 μm）；試驗(yàn)篩（1 mm孔徑）。

1.2 試劑及材料

玉米赤霉烯酮免疫親和柱（容量≥2 μg）；乙腈、甲醇；氫氧化鈉溶液：CNaOH=0.2 mol/l；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，玉米赤霉烯酮含量≥99.5%；提取劑：乙腈+水（8+2）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：將 8 g氯化鈉、1.16 g磷酸氫二鈉、0.2 g磷酸二氫鉀、0.2 g氯化鉀溶解至1 000 ml水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4；流動相：量取460 ml乙腈至1 000 ml的容量瓶中，加入460 ml水和80 ml甲醇。混合均勻并通過0.45 μm濾膜，備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液：用流動相分別配制濃度為 0.02、0.05、0.10、0.50、1.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取試樣40.0 g于250 ml具塞錐形瓶中,加入4.0 g氯化鈉及100.0 ml提取劑,于振蕩器上振蕩60 min,或于高速勻質(zhì)器勻質(zhì)2 min后，用定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0 ml濾液并加入40.0 ml PBS溶液稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1～2次，至濾液澄清，備用。

1.4.2 凈化

將免疫親和柱連接于10.0 ml玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取10.0 ml樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，抽干。分別以10.0 ml純水淋洗柱子兩次并抽干。準(zhǔn)確加入1.5 ml甲醇洗脫，流速不大于2 ml/min，收集洗脫液于55℃氮?dú)獯蹈?，?.0 ml流動相溶解殘?jiān)瑴u旋混勻，過0.45 μm濾膜，上機(jī)測定。

1.4.3 測定

色譜測定流速：0.8 ml/min；檢測波長：激發(fā)波長274 nm；發(fā)射波長 440 nm；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。分別取相同體積樣液和標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀，在同等色譜條件下測定試樣的響應(yīng)值（峰高或峰面積），經(jīng)過與玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜比較響應(yīng)值得到試樣中玉米赤霉烯酮的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 干擾性試驗(yàn)

玉米赤霉烯酮類的六種類似物分別為玉米赤霉烯酮（ZEN）、玉米赤霉醇（ZER）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZOL）、玉米赤霉酮（ZAN）。

該六種物質(zhì)可以應(yīng)用于HPLC紫外法檢測，經(jīng)過玉米赤霉烯酮免疫親和柱凈化后，六種物質(zhì)回收率都大于80%（見圖1）。

六種物質(zhì)中,玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇三種可以用熒光檢測器檢測。該三種物質(zhì)應(yīng)用玉米赤霉烯酮IAC凈化后,從圖2中可以看出,IAC-HPLC熒光檢測法可以很好地將三種物質(zhì)分開。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

配制 ZEN 標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別為 5、20、50、200、500 μg/ml，按上述試驗(yàn)條件進(jìn)樣，以所得峰面積A對濃度（μg/ml）進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明線性關(guān)系良好（見圖3）?；貧w方程為y=1 848.6x-484 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

分別選擇配合飼料、預(yù)混料、魚粉、豆粕、濃縮飼料、玉米不同產(chǎn)品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)。空白樣品選擇不含有玉米赤霉烯酮或含量較低的樣品（含有玉米赤霉烯酮的需扣除空白，見圖4）。樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分搖勻，使標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品充分吸收，按照本試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，其回收率見表1。

表1 飼料中添加玉米赤霉烯酮的準(zhǔn)確度回收率試驗(yàn)

上述不同樣品，在添加不同濃度的情況下，回收率為90.1%～118%，回收效果較好。

表2 飼料中添加玉米赤霉烯酮的精密度回收率試驗(yàn)（%）

利用魚粉、預(yù)混料、雞配合飼料、玉米進(jìn)行添加試驗(yàn)。樣品中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分搖勻，使標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品充分吸收，每個添加水平重復(fù)測定7～9次，按照本試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，其回收率相對偏差見表2。

從表2中數(shù)據(jù)可以看出，在本方法規(guī)定的條件下，回收率數(shù)據(jù)為80.3%～102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)。

3 結(jié)論

玉米赤霉烯酮六種類似物中只有玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇可以用熒光檢測器檢測出來，通過圖譜可以看出，此方法能較好地將這三種物質(zhì)區(qū)分。本試驗(yàn)利用配合飼料、預(yù)混料、魚粉、豆粕、濃縮飼料、玉米進(jìn)行不同濃度的添加回收率試驗(yàn)，回收率為90.1%～118%。利用魚粉、預(yù)混料、雞配合飼料、玉米進(jìn)行方法穩(wěn)定性試驗(yàn)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)。因此，本方法中建立的免疫親和柱凈化-熒光檢測器的高效液相色譜法具有良好的特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。