胃腺癌組織中Cks1和p27kip1表達(dá)的關(guān)系及其預(yù)后價(jià)值

王啟船 王 青 萬里新 屈中玉 盛 晶 (南陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 南陽(yáng) 473009)

浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是胃腺癌發(fā)生發(fā)展過程中重要環(huán)節(jié)，此過程受基因和蛋白多重調(diào)控〔1〕。p27kip1蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的重要基因，其表達(dá)的蛋白參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程。降解是由Skp2完成的，Skp2只有結(jié)合細(xì)胞周期蛋白激酶亞單位1(Cyclin kinase subunit 1，Cks1)才能識(shí)別p27kip1并進(jìn)行泛素化降解，p27kip1和Cks1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在一定相關(guān)性，Cks1是高度保守的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其可以對(duì)p27kip1進(jìn)行泛素化蛋白降解作用〔2〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討胃腺癌組織Cks1和p27kip1表達(dá)關(guān)系及對(duì)預(yù)后的判斷意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 我院2006年1月至2008年2月胃腺癌手術(shù)后預(yù)留的新鮮凍存組織，均符合WHO關(guān)于胃腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前行放、化療;②臨床資料不完整;③合并其他惡性腫瘤。胃腺癌組97例，其中男50例，女47例，年齡42～76(平均58.7)歲。選擇距離腫瘤大于5 cm胃腺癌手術(shù)切緣的正常胃黏膜組織48例為對(duì)照組，其中男25例，女23例，年齡42～74(平均57.4)歲。兩組一般臨床資料無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。

1.2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè) Cks1和p27kip1蛋白均購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，正式檢測(cè)前均進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用不同比例稀釋，摸索最佳比例用于實(shí)驗(yàn)。從冰箱中取出凍存新鮮標(biāo)本約60 g，置于70%的酒精中固定2 d后取出，在不銹鋼網(wǎng)上輕搓并用生理鹽水沖洗，搓盡后去殘?jiān)?。取混懸液，采用銅網(wǎng)過濾后留取細(xì)胞懸液，離心2 min后，制備成單細(xì)胞懸液1×106/ml，取1 ml，分別加入稀釋后的Cks1和p27kip1蛋白一抗，在室溫中放置30 min，加入PBS 10 ml洗滌一次，棄上清，加入FITC-IgG二抗，避光室溫放置30 min，加入PBS 10 ml后離心，棄上清。加入PBS 0.1 ml，過濾后采用美國(guó)BC公司的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)設(shè)用PBS代替一抗和二抗的陰性對(duì)照，以及只加一抗或二抗的陽(yáng)性對(duì)照〔3〕。應(yīng)用 Expo 32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)的分析。

1.3 流式細(xì)胞的結(jié)果判斷 應(yīng)用熒光指數(shù)(FI)表示Cks1和p27kip1蛋白表達(dá)量〔4〕。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS6.12軟件進(jìn)行兩組間t、χ2檢驗(yàn)和線性相關(guān)性分析及生存分析。

2 結(jié)果

2.1 Cks1和p27kip1蛋白在胃腺癌及正常胃黏膜中表達(dá)比較胃腺癌組Cks1(1.34±0.23 vs 1.00±0.23)和p27kip1蛋白表達(dá)量(0.84±0.21 vs 1.00±0.16)與正常胃黏膜組有顯著差異(t=7.64，P=0.003 2;t=5.46，P=0.010 3)。

2.2 Cks1和p27kip1蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白表達(dá)量與浸潤(rùn)深度、TNM分期、PCNA表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。見表1。

表1 Cks1和p27kip1蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白表達(dá)相關(guān)性 經(jīng)線性相關(guān)分析顯示，胃腺癌中Cks1和p27kipl蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=－0.44，P=0.045 1)。

2.4 胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 隨訪8～48(平均26.8)個(gè)月。胃腺癌中 Cks1(χ2=10.11，P＜0.05)和 p27kip1蛋白(χ2=9.96，P＜0.05)表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，即Cks1高表達(dá)、p27kip1蛋白低表達(dá)的患者預(yù)后差。

3 討論

在胃腺癌進(jìn)展過程中，生長(zhǎng)與擴(kuò)散是重要的生物學(xué)行為，此過程中，基因和蛋白改變起重要作用。而且惡性腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞間相互作用是一個(gè)復(fù)雜、多步驟過程，此過程與腫瘤細(xì)胞黏附力、運(yùn)動(dòng)能力、增殖能力和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有明顯關(guān)系〔1〕。Cks1基因位于人類染色體8q21，其序列全長(zhǎng)717 bp，其中有編碼作用的堿基為240 bp，編碼79個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為9×103。Cks1蛋白有3種結(jié)合位點(diǎn)，即Skp2結(jié)合位、Cdk結(jié)合位和陰離子結(jié)合位，這3種結(jié)合位點(diǎn)在SCFSkp2泛素化降解p27的過程中發(fā)揮重要作用〔4〕。

本結(jié)果提示Cks1、p27kip1在胃腺癌形成過程中起重要促進(jìn)作用，二者可能參與腫瘤浸潤(rùn)、生長(zhǎng)、增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，由于以上因素均與腫瘤預(yù)后相關(guān)，而生存分析直接證實(shí)了Cks1和p27kip1蛋白對(duì)預(yù)后的判斷價(jià)值，因此二者聯(lián)合檢測(cè)可能有助于判斷患者預(yù)后。由于胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白之間均呈負(fù)相關(guān)性，提示Cks1和p27kip1蛋白二者之間可能存在著通路作用，即二種蛋白形成獨(dú)立的作用途徑，其作用機(jī)制可能為Cks1作為上游蛋白，調(diào)節(jié)p27kip1蛋白表達(dá)，也可能以Skp2為中介蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)，形成蛋白和基因的連鎖反應(yīng)。Cks1可促進(jìn)泛素化Cyclin-Cdk過程，進(jìn)而抑制 p27kip1蛋白泛素化降解〔5〕。而p27kip1可對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，并抑制相關(guān)蛋白和激酶活性。p27kip1就是通過對(duì)cyclinE/D-CDK2的抑制而使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖時(shí)停滯在G1期，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制細(xì)胞增生并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖〔6〕。Cks1蛋白可有效促進(jìn)p27kip1蛋白泛素化降解，使得p27kip1蛋白在細(xì)胞調(diào)控中的作用減弱，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。但是近年有研究顯示Cks1蛋白參與并促進(jìn)p27kipl蛋白泛素化降解必須具備4個(gè)條件:①由Cyclin E/A-CDK2促使p27kip1蛋白第187位蘇氨酸磷酸化過程。②Skp2在結(jié)構(gòu)中的改變。③Cks1蛋白與Skp2連接后，使Skp2結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，并且有利于Skp2與Skp1穩(wěn)定結(jié)合。④Cks1、Skp2、周期蛋白依賴激酶復(fù)合物的相對(duì)穩(wěn)定。也有研究顯示Cks1可能對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶有調(diào)節(jié)作用〔7〕，破壞基底膜，促使腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)病灶進(jìn)入淋巴循環(huán)或血液循環(huán)中，引起全身轉(zhuǎn)移。因此關(guān)于Cks1和p27kip1的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制可能是多元性的，需要更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

1 劉愛東.Kiss-1在胃癌中的表達(dá)及意義〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011;20(19):2354-5.

2 Wang XC，Tian LL，Tian J，et al.Overexpression of Cks1 increases the radiotherapy resistance of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Radiat Res，2012;53(1):72-8.

3 劉愛東，劉士生，許志萍，等.E-cadherin在胃癌中的表達(dá)及意義〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2007;28(11):1806-7.

4 Lee EK，Kim DG，Kim JS，et al.Cell-cycle regulator Cks1 promotes hepatocellular carcinoma by supporting NF-κB-dependent expression of interleukin-8〔J〕.Cancer Res，2011;71(21):6827-35.

5 Shen DY，F(xiàn)ang ZX，You P，et al.Clinical significance and expression of cyclin kinase subunits 1 and 2 in hepatocellular carcinoma〔J〕.Liver Int，2010;30(1):119-25.

6 Nagler RM，Ben-Izhak O，Ostrovsky D，et al.The expression and prognostic significance of Cks1 in salivary cancer〔J〕.Cancer Invest，2009;27(5):512-20.

7 陳紫萱，黃如欣，張忠英，等.CKS1蛋白在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展〔J〕.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009;6(9):705-6.