果糖制備的糖基化終末產(chǎn)物對(duì)大鼠離體血管環(huán)舒張功能的損傷作用及氯沙坦的保護(hù)機(jī)制

鄭凌云 趙宇紅 (廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州 510006)

動(dòng)物研究證實(shí)，高果糖飲食引起的血管內(nèi)皮功能紊亂在促進(jìn)高血壓形成中有重要作用〔1〕，但其具體的分子基礎(chǔ)并不清楚。研究表明，果糖代謝產(chǎn)生的甲基乙二醛等中間產(chǎn)物可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)，并降低內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放，從而可能引起血管內(nèi)皮功能紊亂〔2〕;而且果糖比葡萄糖更容易引起體內(nèi)生物大分子的非酶糖基化作用〔3〕，從而產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)。因此，高果糖引起的血管內(nèi)皮功能紊亂可能是通過AGEs的形成而介導(dǎo)的。而目前有關(guān)AGEs的研究基本上都是利用葡萄糖制備所得，研究顯示，AGEs可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔4〕。近年來的研究還提示，AGEs引起的血管舒張功能紊亂與血管緊張素受體(AT1)活化密切相關(guān)〔5〕。但對(duì)于果糖制備的AGEs對(duì)血管舒張的影響，以及AT1在其中的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究采用離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，研究高果糖制備的AGEs對(duì)血管環(huán)舒張功能的影響，以及AT1在其中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 D-果糖(純度≥99%，上海生物工程公司)，牛血清白蛋白(BSA，純度≥98%，Sigma公司)，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(boster bio-engineering公司)，p-eNOS(兔抗大鼠，Cell signaling technology)，磷酸化蛋白酶 B(p-AKT，兔抗大鼠，SAB)，powerlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(AD instrument，澳大利亞);雄性SD大鼠200～220 g(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):0098406)，組織裂解液(millipore公司)，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED，Sigma 公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(millipore公司)，抗兔二抗(boster bio-engineering公司)，蛋白酶抑制劑 cocktail(Sigma公司)，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光劑(cell signaling technology公司)，酶聯(lián)免疫分析儀(美國MJ research公司)，垂直電泳裝置(美國Bio-Rad公司)，凝膠掃描分析系統(tǒng)(美國 Advanced American biotechnology公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國Beckman公司)，熒光分光光度儀(HITACHI U3010，Japan)，紫外分光光度儀(島津 UV-265FM，日本)。

1.2 方法

1.2.1 利用果糖制備AGEs并檢測AGEs的形成情況 按文獻(xiàn)方法〔6〕，采用果糖作為還原糖制備糖基化的BSA。具體方法如下:取BSA(10 mg/ml)與D-果糖(250 mmol/L)在磷酸鉀緩沖液(PBS，200 mmol/L，pH7.4)中用二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解，體積分?jǐn)?shù)＜0.2(V/V)，則不影響反應(yīng)進(jìn)行。以上試劑均用0.2 μm濾膜進(jìn)行無菌過濾，并于37℃、5%CO2混合氣體環(huán)境中孵育6 d。反應(yīng)混合物用PBS透析48 h，以除去多余未結(jié)合果糖，用熒光分光光度儀測定產(chǎn)物的熒光密度，其激發(fā)波長為370 nm，發(fā)射波長440 nm。AGEs對(duì)照組采用D-果糖與PBS在同樣條件下孵育6 d，空白對(duì)照組則用BSA與PBS孵育，氨基胍(20 mmol/L)+AGEs作為陽性對(duì)照組。

1.2.2 離體動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 分為空白對(duì)照組、BSA對(duì)照組和 AGEs組以及氯沙坦 50 μmol/L組、氯沙坦10 μmol/L+AGEs組、氯沙坦 50 μmol/L+AGEs組。各組血管環(huán)與AGEs、氯沙坦以及氯沙坦+AGEs的孵育時(shí)間為1 h，隨后分別檢測乙酰膽堿(Ach)介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴的血管舒張(EDR)和硝普鈉(SNP)介導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(NEDR)。

1.2.3 離體動(dòng)脈環(huán)的制備和血管張力測定 取SD大鼠，斷頭處死后，打開胸腔，迅速取出胸主動(dòng)脈條上段，并置于預(yù)冷的Krebs-Henseleit(K-H)液中。K-H液成分(mmol/L):NaCl 120、NaHCO325、KH2PO41.2、MgSO41.2、KCl 4.5、CaCl21.25、glucose 11.1。用顯微器械小心剔除血管周圍的脂肪以及結(jié)締組織，并將血管剪成約3～4 mm的主動(dòng)脈環(huán)后，快速懸掛于離體血管環(huán)灌流裝置中，將灌流浴槽內(nèi)充以37℃的K-H液，并持續(xù)給予95%O2和5%CO2的混合氣體，讓血管環(huán)在無張力情況下維持15 min。逐步調(diào)節(jié)血管環(huán)張力至2 g，并維持1 h，期間每隔15 min換一次液。用100 mmol/L的KCl刺激，反復(fù)三次，以激發(fā)血管環(huán)的最大收縮，如兩次的最大收縮幅度差小于5%認(rèn)為血管反應(yīng)性良好。之后給予10－6mol/L的苯腎上腺素引發(fā)預(yù)收縮，再用10－5mol/L的Ach舒張血管環(huán)以檢查內(nèi)皮的完整性。各組血管環(huán)在藥物處理1 h后，分別測定對(duì)Ach和SNP介導(dǎo)的舒張反應(yīng)。血管環(huán)舒張反應(yīng)以血管舒張力占血流峰值速度(PE)(10－6mol/L)預(yù)收縮時(shí)引起的最大收縮張力的百分比表示，并計(jì)算最大舒張百分率(Emax)。

1.2.4 血管環(huán)組織中NO含量測定 收集各組血管環(huán)，加入冰預(yù)冷的PBS液，冰上進(jìn)行組織勻漿后以4℃、10 000 r/min離心5 min，取上清100 μl進(jìn)行蛋白定量，并按照NO檢測試劑盒說明書用紫外分光光度儀進(jìn)行NO含量測定。

1.2.5 免疫印跡檢測血管環(huán)中eNOS、AKT的磷酸化表達(dá) 收集各組血管環(huán)，加入冰預(yù)冷的組織蛋白裂解液，用顯微剪在冰上剪碎組織，并振蕩裂解30 min，離心取上清，用雙辛可寧酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整各組蛋白上樣量，使每個(gè)加樣孔總蛋白量一致。取一定量蛋白上清液，與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker一起進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDSPAGE)電泳。電泳分離蛋白質(zhì)，卸下分離膠，置于電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡30 min。轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下封閉，孵育p-eNOS抗體(1∶400)以及p-AKT(1∶500)抗體4℃過夜，PBS室溫洗脫，孵育二抗(抗HRP標(biāo)記的二抗稀釋倍數(shù)為1∶1 000)1 h，PBST室溫洗脫1 h，中間換液3次。取發(fā)光試劑盒中的發(fā)光底物溶液和增強(qiáng)劑溶液各0.25 ml，加入去離子水稀釋至5 ml，混勻靜置1 min后，與膜作用3 min，在暗室中，使X光膠片感光。膠片用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)以±s表示，組間采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 果糖制備的AGEs的鑒定和檢測 取AGEs制備各組，進(jìn)行熒光分光光度儀測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到所制備的AGEs的FU值為2 989 FU/ml。用D-果糖或BSA單獨(dú)與PBS孵育并不能形成AGEs，而上述兩者共同孵育后，可在440 nm處得到一個(gè)最大峰，并且用氨基胍作為抑制AGEs形成的陽性對(duì)照藥物，結(jié)果顯示氨基胍有效抑制了果糖所制備的AGEs，提示AGEs制備成功。BSA組、D-果糖組未形成AGEs，AGEs組及AGEs+AS組AGEs形成率分別為98.5%及11.2%。

2.2 AGEs以及氯沙坦對(duì)Ach介導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)的影響 AGEs預(yù)處理大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)1 h后，可明顯抑制Ach引起的內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)，其Emax僅為(32.45±2.93)%(P＜0.01);單獨(dú)氯沙坦(50 μmol/L)預(yù)處理組和AGEs對(duì)照組的BSA均不影響血管環(huán)的內(nèi)皮依賴性舒張，兩組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其Emax分別為(82.14±6.14)%和(81.42±2.36)%，提示果糖制備的AGEs可引起血管環(huán)舒張功能降低，而與BSA和氯沙坦藥物本身無關(guān)。見圖1。

圖1 AGEs及氯沙坦對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張反應(yīng)的影響

2.3 AGEs以及氯沙坦對(duì)血管環(huán)組織中NO含量(μmol/mg)的影響 AGEs預(yù)處理血管環(huán)1 h后，與對(duì)照組BSA(113.47±4.73)相比，NO含量(88.41±5.32)明顯降低(P＜0.01)，而氯沙坦10 μmol/L(92.43±2.85)不能有效逆轉(zhuǎn)AGEs抑制作用(P＞0.05)，50 μmol/L氯沙坦(102.42 ±3.57)可較明顯的恢復(fù)血管壁中NO產(chǎn)生(P＜0.05)。而單獨(dú)應(yīng)用氯沙坦50 μmol/L組血管環(huán)組織中NO含量為(110.84±5.16)μmol/mg，提示AGEs可能通過抑制NO合成導(dǎo)致血管環(huán)內(nèi)皮依賴舒張功能降低，氯沙坦則可逆轉(zhuǎn)這一作用，進(jìn)一步說明AGEs可能活化血管內(nèi)皮細(xì)胞的AT1而影響NO的生成。

2.4 AGEs以及氯沙坦對(duì)血管環(huán)中eNOS和AKT磷酸化的影響 AGEs預(yù)處理血管環(huán)1 h后，血管環(huán)中eNOS活性明顯下降(P＜0.01)，而對(duì)照組BSA和單獨(dú)氯沙坦藥物處理1 h后，血管環(huán)中eNOS無顯著差別，提示AGEs引起的血管舒張功能降低與其抑制eNOS磷酸化有關(guān)。給予氯沙坦(10 μmol/L)和AGEs共同孵育1 h后，血管環(huán)中eNOS活性與單純AGEs處理組相比有所升高(P＜0.05);而50 μmol/L氯沙坦可明顯恢復(fù)eNOS活性(P＜0.01)，提示AGEs引起的血管舒張損傷機(jī)制可能與AT1受體的活化有關(guān)。進(jìn)一步檢測AKT磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGEs預(yù)處理后AKT磷酸化與BSA對(duì)照組相比明顯下調(diào)(P＜0.01)，而氯沙坦可恢復(fù)AKT磷酸化，提示AGEs引起的eNOS活性降低可能是通過AT1受體抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑活化，進(jìn)而引起血管環(huán)舒張功能損傷。見圖2。

圖2 AGEs及氯沙坦對(duì)血管環(huán)eNOS和AKT磷酸化的影響

3 討論

AGEs在糖尿病血管并發(fā)癥中有十分重要的作用〔7〕。研究證實(shí)，高果糖飲食會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能紊亂〔8〕，但其具體的分子基礎(chǔ)并不十分清楚。既往研究〔9〕和本文結(jié)果都證實(shí)，果糖和BSA在37℃條件下共同孵育6 d即可生成AGEs，因此提示高果糖對(duì)血管的舒張功能損傷可能與促進(jìn)AGEs的形成有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法，用果糖作為還原糖，對(duì)BSA進(jìn)行修飾以得到AGEs。用AGEs預(yù)處理大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)1 h后，發(fā)現(xiàn)果糖制備的AGEs引起內(nèi)皮完整的血管環(huán)對(duì)Ach的舒張反應(yīng)明顯下降，而對(duì)硝普鈉引起的血管環(huán)舒張無顯著作用，提示果糖制備的AGEs主要引起內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)受損，這與葡萄糖制備的AGEs的損傷作用相似。進(jìn)一步觀察了血管環(huán)組織中eNOS磷酸化的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與BSA組相比，AGEs可明顯降低eNOS的磷酸化水平，而氯沙坦與AGEs共同孵育血管環(huán)后，eNOS磷酸化水平有所增加，而50 μmol/L氯沙坦本身對(duì)eNOS的磷酸化水平與BSA的作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示果糖制備的AGEs可能通過抑制eNOS活性、降低內(nèi)皮細(xì)胞來源的NO水平引起舒張功能下調(diào)，而50 μmol/L的氯沙坦可明顯逆轉(zhuǎn)這一變化，進(jìn)一步提示AT1介導(dǎo)了AGEs引起的急性血管舒張功能損傷過程;有研究表明，葡萄糖制備的AGEs引起的血管內(nèi)皮損傷與PI3K/AKT活性有關(guān)〔4〕，因此，本文還觀察了各組血管環(huán)中AKT的磷酸化水平，結(jié)果顯示果糖制備的AGEs顯著降低AKT的磷酸化，而氯沙坦預(yù)處理后可恢復(fù)AKT磷酸化水平，提示果糖制備的AGEs引起的eNOS活性下降與PI3K/AKT信號(hào)途徑有關(guān)，而氯沙坦的保護(hù)作用則說明AT1活化參與急性AGEs引起的血管舒張功能損傷。通過檢測血管環(huán)中NO含量，本文也證實(shí)AGEs的損傷作用與NO合成下調(diào)有關(guān)。進(jìn)一步的分子機(jī)制還需要在細(xì)胞水平進(jìn)行研究。

綜上所述，高果糖制備的AGEs可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，但在制備AGEs的時(shí)間上明顯短于葡萄糖，提示果糖在誘導(dǎo)AGEs形成中的重要性。而且，果糖制備的AGEs能明顯損害內(nèi)皮的eNOS活性，從而引起NO生成降低，而AT1阻斷劑氯沙坦的保護(hù)作用提示急性的AGEs引起的血管舒張反應(yīng)降低也與AT1活化有關(guān)，并且可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)途徑調(diào)控eNOS的活化。

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