骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠血管成形術(shù)后內(nèi)膜增生及炎癥因子表達(dá)的影響

束 波 范 芳 (遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563003)

再狹窄是經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈介入術(shù)(PCI)術(shù)后的主要并發(fā)癥，目前發(fā)生機(jī)制仍不明確。現(xiàn)有的研究表明再狹窄的發(fā)生主要與局部的炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能下降等有關(guān)，其中血管炎癥反應(yīng)也起了十分重要的作用〔1〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多項(xiàng)分化潛能，經(jīng)過血管內(nèi)皮生長因子等因子的誘導(dǎo)，可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞;此外，與成熟內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)可以促進(jìn)其向內(nèi)皮方向分化，并部分抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。BMSCs還具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，參與多種免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)〔2〕。研究表明BMSCs這一作用與調(diào)節(jié)IL-10等相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)〔3〕。由此推測BMSCs移植對血管損傷后的炎癥反應(yīng)可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。本研究擬觀察移植BMSCs對損傷血管炎癥因子表達(dá)及新生內(nèi)膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國);DAPI(Sigma公司，美國);Percoll分離液(Pharmacia公司，美國);核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65(NF-κBp65)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)一抗(武漢博士德公司);通用型免疫組化二抗試劑盒，ELISA檢測試劑盒，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。2F球囊導(dǎo)管(Cordis公司，美國)。圖像分析系統(tǒng)(Leica Qwin Plus公司，德國)。倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組 雄性SD大鼠48只，2～3個月齡，體重質(zhì)量200～300 g。大鼠右側(cè)頸總動脈行球囊損傷后隨機(jī)分為BMSCs組(n=24)和模型組(n=24)，BMSCs組接受BMSCs經(jīng)尾靜脈移植，對照組接受等量的PBS液注射。

1.3 BMSCs的培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記 無菌條件下分離大鼠股骨，PBS液沖洗后獲取新鮮骨髓液，通過密度梯度離心法分離出其中的單個核細(xì)胞，接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/ml的L-DMEM完全培養(yǎng)液中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)2 d后首次換液，以后每2～3 d換培養(yǎng)液，BMSCs增殖到80% ～90%時傳代。移植前用DAPI(50 mg/L)對BMSCs進(jìn)行標(biāo)記，置于37℃孵育箱中孵育30 min，再用PBS洗4～5次除去結(jié)合的DAPI。

1.4 頸總動脈球囊損傷模型的制備及細(xì)胞的移植 大鼠麻醉后分離右側(cè)頸內(nèi)、外動脈和頸總動脈。送入2F球囊至頸總動脈，生理鹽水充盈球囊后緩慢拖動，持續(xù)1 min，間歇1 min后重復(fù)，共3次，使頸總動脈損傷長度大約2～3 cm，退出球囊，結(jié)扎頸外動脈，恢復(fù)前向血流。然后將事先已標(biāo)記好的BMSCs 5×106/ml的總量通過頸外動脈注入損傷血管局部，對照組注入同等體積PBS，孵育30 min后恢復(fù)血流。

1.5 移植組血管內(nèi)膜BMSCs歸巢的檢測 術(shù)后7 d取BMSCs組頸動脈，PBS反復(fù)沖洗后將血管縱向切開，平鋪在載玻片上，置入4%多聚甲醛中固定30 min，鋪上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜DAPI陽性標(biāo)記的BMSCs的歸巢。

1.6 ELISA法檢測血清TNF-α和IL-10濃度 術(shù)后7、14、28 d采血室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min分離血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-10的濃度。

1.7 免疫組化染色檢測NF-κBp65、α-SAM及PCNA表達(dá) 術(shù)后14 d，留取部分損傷和正常血管組織用4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋等處理后橫斷面切片5 μm，利用SABC法進(jìn)行NF-κBp65、α-SMA、PCNA免疫組化染色。采集圖像后，通過圖像分析軟件計(jì)算積分光密度值分析NF-κBp65、α-SAM水平;計(jì)數(shù)新生內(nèi)膜、中膜的陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，分別取其平均數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)為該部位PCNA的陽性率。

1.8 蘇木素-伊紅(HE)染色分析 術(shù)后28 d處死動物，留取部分損傷和正常血管組織用4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋等處理后橫斷面切片5 μm，進(jìn)行常規(guī)HE染色。采集圖像后通過計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)測定新生內(nèi)膜面積、中膜面積及新生內(nèi)膜面積/中膜面積。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量資料以±s表示，組間比較采用成組資料的t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的培養(yǎng)及標(biāo)記 培養(yǎng)的第三代BMSCs呈現(xiàn)梭形、網(wǎng)狀貼壁排列生長。DAPI標(biāo)記后細(xì)胞核發(fā)藍(lán)光，標(biāo)記率達(dá)100%。見圖1。

2.2 BMSCs歸巢的檢測 術(shù)后7 d，BMSCs移植組血管內(nèi)膜可見DAPI-BMSCs的細(xì)胞核發(fā)藍(lán)色熒光。見圖2。

2.3 NF-κBp65、PCNA及α-SMA的免疫組化分析 與對照組相比，術(shù)后14 d BMSCs組新生內(nèi)膜和(或)中膜中NF-κBp65(0.32± 0.02 vs 0.19±0.01，P＜0.05)、α-SMA(0.64± 0.06 vs 0.32±0.04，P＜0.01)的平均吸光度值明顯降低;BMSCs組的PCNA陽性細(xì)胞率亦較對照組明顯降低〔(55.46±2.6)%vs(25.41±2.2)%，P＜0.05〕。見圖3。

圖1 BMSCs的培養(yǎng)和標(biāo)記(×100)

圖2 DAPI標(biāo)記的BMSCs歸巢至血管內(nèi)膜(×400)

2.4 血清TNF-α 和 IL-10濃度變化 術(shù)后7、14、28 d，BMSCs組血清TNF-α濃度均較對照組明顯降低(P＜0.01)，而血清IL-10的濃度對照組顯著升高(P＜0.01)。見表1，表2。

表1 不同時間點(diǎn)各組血漿中TNF-α的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

表1 不同時間點(diǎn)各組血漿中TNF-α的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

與同一時間點(diǎn)的對照組比較:1)P＜0.01;下表同

組別 術(shù)前 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 術(shù)后28 d對照組 32.35±4.63 75.21±5.62 62.07±3.54 46.73±4.68 BMSCs組 34.68±5.38 66.48±4.581)48.60±3.131)40.59±4.471)

表2 不同時間點(diǎn)各組血漿中IL-10的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

表2 不同時間點(diǎn)各組血漿中IL-10的濃度變化(pg/ml，± s，n=8)

組別 術(shù)前 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 術(shù)后28 d組別 術(shù)前 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 術(shù)后28 d對照組 34.43±4.76 45.21±6.85 37.07±5.82 27.73±3.78 BMSCs組 36.57±6.34 67.48±4.871) 50.60±6.331) 40.76±5.481)

2.5 血管形態(tài)學(xué)分析 術(shù)后28 d，對側(cè)未損傷血管內(nèi)彈力板完整，血管內(nèi)膜可見單層內(nèi)皮細(xì)胞，無新生內(nèi)膜增生;對照組內(nèi)彈力板斷裂，新生內(nèi)膜明顯增生，增生平滑肌細(xì)胞排列紊亂。BMSCs組新生內(nèi)膜增生較對照組明顯減輕，新生內(nèi)膜面積、新生內(nèi)膜面積/中膜面積均顯著低于對照組。見圖4。

圖3 NF-κBp65、PCNA及α-SMA的免疫組化染色(×200)

圖4 各組血管形態(tài)學(xué)分析(×100)

表3 BMSCs移植后28 d對血管新生內(nèi)膜增生的影響(± s，n=8)

表3 BMSCs移植后28 d對血管新生內(nèi)膜增生的影響(± s，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05

組別 內(nèi)膜面積(mm2) 中膜面積(mm2) 內(nèi)膜/中膜(%)對照組0.284±0.023 0.124±0.011 2.290±0.212 BMSCs組 0.104±0.0271) 0.132±0.012 0.787±0.0921)

3 討論

PCI是目前冠心病治療的重要方法。急診PCI的動物模型顯示其體內(nèi)釋放的大量細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)物及血管平滑肌的增殖和遷移是血管再狹窄發(fā)生的重要原因〔4〕。再狹窄嚴(yán)重影響遠(yuǎn)期預(yù)后，因此，如何有效抑制血管炎癥反應(yīng)并減輕血管成形術(shù)后再狹窄程度具有重要意義。

BMSCs是來源于骨髓的成體干細(xì)胞。研究證實(shí)BMSCs具有多向分化潛能，可分化為內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等〔5〕;BMSCs還具有旁分泌作用，分泌多種生長因子參與損傷組織修復(fù)〔6〕;此外，BMSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，免疫原性低〔7〕，還有獨(dú)特的免疫抑制特性，可以抑制淋巴細(xì)胞增殖和抗原呈遞細(xì)胞的活化與成熟。體外研究發(fā)現(xiàn)，用來源于BMSCs的培養(yǎng)液能改善MCP-1導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷;移植BMSCs到大鼠病毒性心肌組織，可抑制趨化因子的表達(dá)和炎性細(xì)胞在心肌的局部浸潤〔8〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植后降低了梗死心肌局部TNF-α、IL-1表達(dá)，改善心臟功能〔9〕。以上均說明 BMSCs可參與免疫及炎癥疾病的治療。

NF-κB是機(jī)體調(diào)控細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，在參與機(jī)體防御功能及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。p50/p52和p65亞單位是NF-κB的活性形式。NF-κBp65進(jìn)入細(xì)胞核后啟動基因轉(zhuǎn)錄，可上調(diào)TNF-α、IL-10等炎癥因子表達(dá)〔10〕。這些炎癥因子可介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮間的黏附反應(yīng)，使白細(xì)胞浸潤到損傷血管壁引起血管炎癥。TNF-α、CRP等炎癥因子與支架置入后血管再狹窄發(fā)生密切相關(guān)〔11〕。Wang 等〔12〕發(fā)現(xiàn)血管損傷后 NF-κB表達(dá)與新生內(nèi)膜增生呈正相關(guān)，表明NF-κB激活引起的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)膜增生。本研究也發(fā)現(xiàn)，球囊損傷大鼠頸總動脈14 d后對照組新生內(nèi)膜有NF-κBp65表達(dá)，并伴PCNA和α-SMA的表達(dá)明顯增加，血漿 TNF-α濃度升高。由此可見，血管 NF-κBp65的激活調(diào)節(jié)了TNF-α濃度升高，參與了血管損傷后的炎癥反應(yīng)及新生內(nèi)膜的增生。

新近的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs能分泌TSG-6(TNF-α stimulated gene/protein 6)，抑制NF-κB激活，進(jìn)而抑制下游炎癥因子的表達(dá)〔13，14〕。此外，TSG-6還能作用于巨噬細(xì)胞分泌抗炎癥因子IL-10〔15〕。Dhingra 等〔16〕發(fā)現(xiàn) IL-10 可通過抑制 NF-κB 活性，進(jìn)而下調(diào)TNF-α的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，BMSCs移植可能通過升高IL-10的表達(dá)并下調(diào)損傷血管局部NF-κBp65表達(dá)，進(jìn)而抑制下游炎癥因子表達(dá)，從而減輕損傷血管炎癥反應(yīng)和新生內(nèi)膜的增生。

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