不同給藥途徑伊立替康在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度

繳萬(wàn)里 劉海潔 張熙杰 張桂榮 王玉紅 曹德英 (唐山市工人醫(yī)院藥學(xué)部，河北 唐山 06000)

鹽酸伊立替康 (Irinotecan Hydrochloride)是喜樹(shù)堿類上市的新藥之一，是用于轉(zhuǎn)移性結(jié)、直腸癌一線治療的化療藥，對(duì)氟尿嘧啶耐藥病例仍有效〔1，2〕。目前市場(chǎng)上伊立替康僅有注射劑一種劑型，主要的不良反應(yīng)為中性粒細(xì)胞減少癥和腹瀉，長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用患者難以耐受。因?yàn)樽⑸鋭┦褂貌环奖?，患者依從性差。而且伊立替康在臨床使用時(shí)都必須佩戴眼鏡、口罩、手套，給醫(yī)務(wù)人員的操作帶來(lái)很多困難。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，動(dòng)物口服伊立替康后有一定的生物利用度，提示伊立替康可以血管外給藥。因此，為使患者用藥更加方便、安全，本文試制了伊立替康中空栓，并以市售的注射用鹽酸伊立替康為參比制劑，研究伊立替康中空栓在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和絕對(duì)生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 美國(guó)Waters 2690高效液相色譜儀及474熒光檢測(cè)器，Millennium32數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Agilent TC-C18色譜柱;ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠);TGL-16C型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海弗魯克機(jī)電設(shè)備有限公司);800型臺(tái)式離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠);PHS-3C型臺(tái)式精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);分析天平(上海天平儀器廠);Gilson P型移液器(法國(guó))。

1.1.2 試劑 鹽酸伊立替康(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):616090901);注射用鹽酸伊立替康(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):10032311);伊立替康中空栓(自制，每枚含伊立替康80 mg);甲醇、乙腈為色譜純;磷酸氫二鈉、辛烷基磺酸鈉、磷酸為分析純;重蒸餾水(自制)。

1.1.3 動(dòng)物 健康家兔(大耳白家兔，許可證編號(hào):SCXK(京)2009-0014)，體重(2.5±0.3)kg，雌雄兼用，母兔無(wú)孕。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6×150 mm;5 μm);進(jìn) 樣 量 10 ～ 50 μl;流 動(dòng) 相:0.05 mol/L Na2HPO4(pH3.0，內(nèi)含 0.05 mol/L 辛烷基磺酸鈉)-乙腈 =68∶32〔3〕;流速1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):Ex 370 nm，Em 430 nm;柱溫:室溫。

1.2.2 樣品處理 取含藥血漿200 μl，加600 μl冷甲醇，渦旋混合30 s，離心，取上清液10～50 μl進(jìn)樣分析。

1.2.3 給藥方法及血樣采集 取健康家兔10只，隨機(jī)分為兩組，每組5只。第1組為靜脈注射組;第2組為伊立替康中空栓直腸給藥組。用藥前，家兔禁食12 h，自由飲水，用藥后6 h開(kāi)始進(jìn)食。靜脈組于耳緣靜脈注射鹽酸伊立替康，給藥劑量為60 mg/只〔4〕，分別于給藥后 0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h耳緣靜脈取血1.0 ml，加至預(yù)先加入肝素的塑料試管中，立即離心(4℃，2 000 r/min×10 min)，分離得到血漿樣品。直腸給藥組由直腸給予伊立替康中空栓2枚，封閉肛門，給藥劑量為 160 mg/只〔4〕，分別于給藥后 0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24、48 h 耳緣靜脈取血 1.0 ml，加至預(yù)先加入肝素的塑料試管中，立即離心(4℃，2 000 r/min×10 min)，分離得到血漿樣品。同上述“1.2.2”方法進(jìn)行處理。

1.2.4 制備標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱量鹽酸伊立替康標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用0.01 mol/L HCl溶液定容于25 ml量瓶中，得200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將其稀釋配制成20 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。取1.9 ml空白血漿，加入100 μl鹽酸伊立替康標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，配成1 000 ng/ml的伊立替康標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，再用空白血漿逐步稀釋，配制成伊立替康濃度分別為 25、50、100、250、500、1 000 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取伊立替康系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“1.2.2”方法處理后，進(jìn)樣10 ～50 μl，得到對(duì)應(yīng)的峰面積，重復(fù)3次，以標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度對(duì)應(yīng)的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，其系列濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線A=bC+a。

1.2.6 回收率測(cè)定

1.2.6.1 提取回收率 按標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法，取兔空白血漿，加入一定體積的鹽酸伊立替康標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為80、400、800 ng/ml的血漿樣品，按“1.2.2”方法處理，進(jìn)樣 50 μl，作高效液相色譜法(HPLC)分析，記錄峰面積，與同濃度的鹽酸伊立替康標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)樣10～50 μl所測(cè)定的峰面積比較，計(jì)算提取回收率。

1.2.6.2 方法回收率 按標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備方法，取兔空白血漿，加入一定體積的鹽酸伊立替康標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為80、400、800 ng/ml的血漿樣品，按“1.2.2”方法處理，進(jìn)樣10～50 μl，記錄峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的濃度為伊立替康的測(cè)定濃度，伊立替康的測(cè)定濃度與實(shí)際濃度的比值為方法回收率。

1.2.7 精密度測(cè)定 每日每種濃度方法回收率各測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度。連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 兩組動(dòng)物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)按統(tǒng)計(jì)矩的非隔室動(dòng)力學(xué)理論計(jì)算〔4〕，藥-時(shí)曲線下面積(AUC)用梯形面積法計(jì)算，消除速率常數(shù)(Ke)由藥-時(shí)曲線上末端4點(diǎn)求得，最大血藥濃度(Cmax)和最大血藥濃度對(duì)應(yīng)時(shí)間(Tmax)采用實(shí)測(cè)值。以直腸給藥組AUC(0-inf)比靜脈注射組AUC(0-inf)，計(jì)算伊立替康中空栓的絕對(duì)生物利用度(F)，公式如下:

2 結(jié)果

2.1 HPLC色譜圖 在選定條件下測(cè)得的色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，伊立替康的保留時(shí)間約為6.1 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以伊立替康標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度對(duì)應(yīng)的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，其系列濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=215.08C－312.90(r=0.999 7，n=6)，結(jié)果表明，伊立替康血藥濃度在25～1 000 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 25、50、100、250、500、1 000 ng/ml伊立替康對(duì)應(yīng)的峰面積分別為 6 923、10 441、21 145、53 491、103 647、216 513。以信噪比為3，最低檢測(cè)限10 ng/ml。見(jiàn)圖2。

2.3 回收率測(cè)定 80、400、800 ng/ml三種濃度的提取回收率分別為(89.08±4.682)%、(90.23±3.668)%、(88.91±2.776)%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為5.256%、4.030%、3.120%;方法回收率分別為(107.14±7.163)%、(96.76±5.658)%、(101.46±4.417)%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為6.69%、5.85%、4.35%。

2.4 精密度測(cè)定 80、100、800 ng/ml三種濃度的日內(nèi)精密度分別為 4.54% 〔(86.11±3.908)%〕、4.66% 〔(398.75±18.572)%〕、2.96%〔(815.69±24.167)%〕。日間精密度分別為 8.35% 〔(85.71 ±7.157)%〕、5.44% 〔(377.48 ±20.548)%〕、5.40%〔(809.58±43.677)%〕。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)分析 家兔靜脈注射60 mg伊立替康和直腸給予160 mg伊立替康后，半衰期(T1/2)、表觀分布容積(Vss)、消除速度常數(shù)(Ke)、機(jī)體總清除率(CL)、AUC(0-inf)、峰濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)見(jiàn)表1。家兔靜脈注射伊立替康后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3，家兔直腸給予伊立替康中空栓后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖4。伊立替康中空栓的平均絕對(duì)生物利用度為11.34%。

圖1 HPLC色譜圖

圖2 血漿中伊立替康的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 家兔注射伊立替康后平均血藥濃度-時(shí)間曲線

表1 不同伊立替康給藥方式主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(± s，n=5)

表1 不同伊立替康給藥方式主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(± s，n=5)

參數(shù) 伊立替康注射液 伊立替康中空栓T1/2(h)15.599 9±6.479 4 22.505 2±7.282 4 Tmax(h) 1 4 Cmax(μg/ml) 17.853 3±0.906 8 3.065 3±0.178 6 Ke 0.050 1±0.020 9 0.033 4±0.010 7 Vss(ml/kg) 63.889 1±8.938 2 313.207 7±78.420 6 CL(ml·h－1·kg－1) 15.910 0 ±1.850 4 52.528 0 ±4.924 4 AUC(0-inf)(μg·h－1·ml－1)63.419 5 ±7.315 3 19.175 9 ±1.969 3 F(%)－11.34

圖4 家兔直腸給藥伊立替康中空栓劑后平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

鹽酸伊立替康目前已被廣泛用于大腸癌、小細(xì)胞肺癌以及胃癌等實(shí)體瘤的治療中，并經(jīng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，其能夠明顯延長(zhǎng)患者生存期，但血液學(xué)毒性和消化道反應(yīng)嚴(yán)重限制了伊立替康的臨床應(yīng)用〔5〕。已有研究研究表明，鹽酸伊立替康在動(dòng)物和人體內(nèi)的消除方式主要為肝代謝和膽汁分泌〔6〕。與其代謝相關(guān)的酶包括羧酸酯酶(CEs)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)、細(xì)胞色素P450(CYP3A)以及β-葡萄糖苷酸酶等。鹽酸伊立替康在體內(nèi)外易受羧酸酯酶的影響而轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物10-羥基-7-乙基喜樹(shù)堿(SN-38)，也能夠通過(guò)CYP3A途徑形成無(wú)活性的氧化產(chǎn)物。

1984 年日本學(xué)者渡道善照首次制備成中空栓劑，其外層為基質(zhì)制成的殼，空心可填充固體、液體或混懸液狀態(tài)的藥物。為哮喘、糖尿病、貧血和癌癥等慢性病的長(zhǎng)期治療提供了適合的劑型，能替代某些注射劑、灌腸劑，劑量準(zhǔn)確，應(yīng)用方便，緩釋的中空栓可減少用藥頻率，增加病人的順應(yīng)性。

本研究結(jié)果表明，伊立替康靜脈給藥的Vss值比直腸給藥的Vss值小很多，說(shuō)明靜脈給藥的血藥濃度要高于直腸給藥的血藥濃度;伊立替康注射劑在注射后約1 h出現(xiàn)反彈濃度，提示該藥存在肝腸循環(huán)，而伊立替康中空栓在給藥后6～8 h血藥濃度基本不變，與大鼠口服伊立替康后的血藥濃度相似〔4〕;伊立替康直腸給藥后，有一定的生物利用度，提示直腸給藥有可能成為伊立替康的另一給藥途徑。

然而，伊立替康在體內(nèi)代謝為活性產(chǎn)物SN-38，由于沒(méi)有SN-38的標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)法同時(shí)定量測(cè)定。另外，由于伊立替康中空栓含藥量為80 mg/枚，每只家兔用兩枚中空栓，直腸內(nèi)基質(zhì)較多，可能影響了伊立替康的吸收。因此，有待于通過(guò)進(jìn)一步研究揭示伊立替康中空栓劑藥代動(dòng)力及生物利用度的特點(diǎn)。

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