低溫誘導(dǎo)甜菜(Beta vulgaris L.)Ty7Br600基因的Northern blotting和Southern blotting分析

戴建軍，程大友，常 纓，李彩鳳，閆桂萍，馬鳳鳴

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150001；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

甜菜（Beta vulgaris L.）是二年生作物，通常情況下第一年進(jìn)行營養(yǎng)生長，第二年經(jīng)春化作用后塊根發(fā)芽、抽薹。但是，由于某些原因甜菜也會(huì)出現(xiàn)當(dāng)年抽薹的現(xiàn)象，稱為早抽薹。早抽薹植株消耗大量光合產(chǎn)物用于生殖生長，影響塊根增長和糖分積累，致使塊根產(chǎn)量減產(chǎn)可達(dá)20%，含糖率甚至可降低1.6%，工藝品質(zhì)差，不耐貯藏，嚴(yán)重影響甜菜的生產(chǎn)。國內(nèi)外研究認(rèn)為遺傳與環(huán)境因素都能影響甜菜抽薹。二年生甜菜抽薹需要低溫和長日照才能表達(dá)[1-2]。對(duì)于一定的甜菜品種，早抽薹主要是低溫的累積作用繼之以長日照或低溫與長日照相伴的誘導(dǎo)結(jié)果[3-5]。二年生甜菜幼苗在0～10℃溫度下，連續(xù)光照，可以誘導(dǎo)其抽薹[6]。Barzen等首先用RFLP方法繪制了甜菜重要農(nóng)藝性狀的染色體連鎖圖譜，抽薹基因B位于xxpKP826標(biāo)記之間[7]；Schondelmaier等將以上連鎖標(biāo)記確定在II號(hào)染色體上[8]。El-Mezawy等用AFLP分子標(biāo)記方法篩選到17個(gè)距顯性等位基因位點(diǎn)B不到3.2 cM的標(biāo)記位點(diǎn)，其中有2個(gè)標(biāo)記距B基因只有0.14和0.23 cM，還有2個(gè)標(biāo)記為0.5 cM[9]。Abe等將甜菜抽薹前的生長階段分為植物對(duì)低溫感應(yīng)階段（春化階段，要求低溫性的基因起作用）和環(huán)境因子感應(yīng)階段（后春化階段），感應(yīng)日照及溫度的基因起作用。通過傳統(tǒng)的雜交試驗(yàn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)影響抽薹性幾個(gè)主要基因，如一年生甜菜抽薹基因B、B'基因的等位基因易抽薹基因和晚抽薹基因lb[2,10]，但至今對(duì)甜菜抽薹基因片段序列及其特性的報(bào)道還很少。

本研究在利用代表性差異分析cDNA-RDA技術(shù)克隆了低溫誘導(dǎo)的甜菜幼苗差異表達(dá)基因片段和cDNA的末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends）的基礎(chǔ)上獲得的Ty7Br600基因片段序列，進(jìn)行Northern和Southern雜交分析。探討了二年生甜菜當(dāng)年抽薹的相關(guān)基因Ty7Br600的特性，為揭示二年生甜菜當(dāng)年抽薹的分子機(jī)理以及甜菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)與低溫誘導(dǎo)

二年生栽培甜菜甜研7號(hào)（Ty7），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物栽培系提供。

Ty7甜菜種子在室溫下浸種7 h，置于培養(yǎng)皿中25℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，萌發(fā)后置2～4℃低溫處理72 d，光照16 h，誘導(dǎo)抽薹。以25℃恒溫箱中萌發(fā)2～3 d的幼苗為對(duì)照。

1.2 RNA提取

將誘導(dǎo)抽薹前、后采集的甜菜莖尖樣品，按照Trizol試劑盒（GibcolBRL公司）操作程序提取莖尖RNA。具體方法參見文獻(xiàn)[11]。進(jìn)一步通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3 Northern雜交分析

甜菜幼苗分別于低溫誘導(dǎo)前后進(jìn)行采樣，Trizol提取總RNA，分別取等量的總RNA進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，烘干，42℃預(yù)雜交3 h。以Ty7的cDNA為模板，根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]克隆的Ty7Br600序列結(jié)果設(shè)計(jì)A49（5'CGAAAGCGGCATAGCAAAGGAA 3'）和B75（5'ACATAAGCGCAGCCAGTAACAT 3'）為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段后，用Promega公司的隨機(jī)引物標(biāo)記Kit Prime-a-Gene?Labeling System，以α-32P-dATP標(biāo)記，雜交及雜交后洗滌。將洗好的膜在空氣中稍晾干后，用保鮮膜包好，在暗室中定位于暗盒中，做好標(biāo)記，-70℃放射自顯影3～7 d。經(jīng)顯影、漂洗、定影獲得雜交結(jié)果，參照文獻(xiàn)[11]程序。

1.4 Southern雜交分析

用SDS法提取甜菜幼苗DNA，取約16 μg基因組DNA，用Eco RⅠ、HindⅢ進(jìn)行酶切，電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，烘干，預(yù)雜交。以克隆的全長cDNA片段為探針，探針標(biāo)記、雜交及雜交后洗滌，放射自顯影，參照文獻(xiàn)[11]程序。

2 結(jié)果與分析

2.1 Northern雜交分析

2.1.1 探針的制備

以Ty7的cDNA為模板，以A49和B75為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增回收的片段回收后，隨機(jī)引物標(biāo)記后作探針。瓊脂糖電泳檢測結(jié)果見圖1。

圖1 探針的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the probe

2.1.2 Northern印記雜交

以PCR擴(kuò)增獲得差別表達(dá)基因片段，按隨機(jī)引物標(biāo)記法制成探針，并用來與未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)培養(yǎng)的甜菜幼苗RNA群體進(jìn)行Northern雜交。結(jié)果在低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)的甜菜幼苗的RNA群體中，出現(xiàn)較強(qiáng)的雜交條帶，而在未誘導(dǎo)培養(yǎng)的甜菜幼苗的RNA群體中，則沒有陽性雜交條帶出現(xiàn)（見圖2）。Northern雜交試驗(yàn)結(jié)果說明，Ty7Br600這一序列有可能是二年生甜菜幼苗經(jīng)低溫誘導(dǎo)處理之后被誘導(dǎo)特異表達(dá)的與抽薹相關(guān)的新基因序列。

圖2 Northern印記雜交Fig.2 Northern blotting hybridization

2.2 Southern雜交分析

2.2.1 DNA的提取及純化

用SDS法提取甜菜葉片基因組DNA，進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。

圖3 甜菜葉片基因組DNA的提取Fig.3 Isolation of genomic DNA of Beta vulgaris L.

由圖3可知，甜菜基因組DNA為10kb以上，提取純化后的DNA無降解，完全可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.2 DNA的限制性內(nèi)切酶酶切

分別用Eco RⅠ，Bam HⅠ和HindⅢ對(duì)Ty7 DNA進(jìn)行酶切，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖4所示。

圖4 甜菜基因組DNA的限制性內(nèi)切酶消化Fig.4 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of Beta vulgaris L.degested with restriction endonucleases

2.2.3 Ty7Br600基因在甜菜基因組中的分布

以500 bp的cDNA差異片段為探針，與基因組DNA進(jìn)行Southern雜交。由圖5可知，這些差異cDNA片段探針同經(jīng)酶切消化的基因組DNA進(jìn)行Southern雜交時(shí)，在每一組酶切中至少有2～3條條帶，且有1條帶的強(qiáng)度明顯高于其他條帶，表明這些cDNA差異片段確為甜菜基因組片段，也同時(shí)表明該基因在甜菜基因組中以2個(gè)拷貝或低拷貝形式存在。

圖5 Southern印記雜交Fig.5 Southern blotting hybridization

3 討論

甜菜當(dāng)年抽薹嚴(yán)重影響甜菜產(chǎn)量、工藝品質(zhì)和貯藏。但隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，揭示甜菜當(dāng)年抽薹機(jī)理，并提出調(diào)控技術(shù)已經(jīng)成為可能。本研究對(duì)已經(jīng)克隆到的低溫和長日照誘導(dǎo)表達(dá)的基因[12-13]，進(jìn)行Northern和Southern雜交分析，探討了二年生甜菜當(dāng)年抽薹的相關(guān)基因特性，為揭示二年生甜菜當(dāng)年抽薹的分子機(jī)理以及甜菜生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

引起甜菜當(dāng)年抽薹的內(nèi)在因素是品種特性，即甜菜一年或二年生的習(xí)性；而外在因素是生態(tài)條件即低溫、長日照等條件。一年生甜菜不需低溫也可以抽薹，但仍需一定的長日照；而二年生甜菜當(dāng)年必須滿足其低溫和長日照等條件，才會(huì)出現(xiàn)當(dāng)年抽薹的現(xiàn)象，抽薹基因B要通過外界因素（如后春化階段的長日照，高溫）才能起作用。因此栽培甜菜當(dāng)年抽薹的機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，不僅涉及到抽薹基因，還受一些與其相互作用的感光性基因影響。國內(nèi)外陸續(xù)有很多報(bào)道。甜菜抽薹是一個(gè)高度復(fù)雜而復(fù)合的，在一定遺傳背景下的生理生化及形態(tài)發(fā)生過程。甜菜植株接受環(huán)境因子誘導(dǎo)后，經(jīng)一系列信號(hào)傳導(dǎo)過程，啟動(dòng)抽薹決定過程中的控制基因。這些過程中許多特異性基因按一定的時(shí)間順序和空間特異性程序啟動(dòng)和關(guān)閉，各個(gè)基因既具有獨(dú)立功能，又相互影響、相互制約。

抽薹性狀本身是一種質(zhì)量性狀，通常由單基因控制[14]，但是甜菜的整個(gè)抽薹過程卻必需經(jīng)過春化過程和適當(dāng)?shù)墓庵芷谡T導(dǎo)，因此就甜菜抽薹整個(gè)過程而言，抽薹過程是一系列春化作用、光周期和抽薹相關(guān)基因的接受外界刺激信號(hào)順序表達(dá)的結(jié)果[2]。遺憾的是，至今對(duì)甜菜抽薹的本質(zhì)和機(jī)理還未研究清楚。要想弄清其本質(zhì)機(jī)理，就必需追根溯源，找到控制甜菜抽薹的主效基因和連鎖的相關(guān)基因，才能從更深的層次即分子水平上解釋甜菜抽薹機(jī)理。如果能克隆出控制甜菜抽薹的主效基因或幾個(gè)關(guān)鍵基因，則可以采用反義RNA控制二年生栽培甜菜抽薹基因的表達(dá)，用基因敲除等生物技術(shù)對(duì)基因組進(jìn)行重建改造，提高產(chǎn)糖量，應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊。

4 結(jié)論

本文分別進(jìn)行Northern印跡和Southern印跡雜交。結(jié)果表明，Ty7Br600 cDNA差異片段只在低溫誘導(dǎo)的甜菜中表達(dá)，在甜菜基因組中以2個(gè)拷貝或低拷貝形式存在。本研究克隆到的低溫和長日照誘導(dǎo)表達(dá)的基因，為研究甜菜抽薹及其調(diào)控的機(jī)理，最終采用生物技術(shù)手段控制甜菜抽薹、降低抽薹率和提高產(chǎn)糖量提供了理論基礎(chǔ)和基因材料。

[1]Owen F V.The significance of single gene reactions in sugar beets[J].Proceedings of the American Society of Sugar Beet Technologists,1954,8:392-398.

[2]Abe J,Guan G P,Shimamoto Y.A gene complex for annual habit in sugar beet（Beta vulgaris L.）[J].Euphytica,1997,94:129-135.

[3]王立方.甜菜抽薹開花的條件及控制技術(shù)的應(yīng)用[J].中國甜菜,1983(2):1-13.

[4]Lasa J M.Sugar beet bolting in the root crop[J].J Agric Sci,1977,89(1):223-238.

[5]Longden P,Clarke N,Thomas T.Why are bolting and flowering important in sugar beet[J].British Sugar Beet Review,1994,62(2):23-26.

[6]王立方.甜菜發(fā)育控制技術(shù)研究.光照和溫度條件對(duì)甜菜抽薹開花的影響[J].甜菜糖業(yè),1979(2):17-28.

[7]Barzen E,Mechelke W,Ritter E,et al.RFLP markers for sugar beet breeding:Chromosomal linkage maps and location of major genes for rhizomania resistance,monogermy and hypocotyl colour[J].Plant Journal,1992,2:4,601-611.

[8]Schondelmaier J,Jung C.Chromosomal assignment of the nine linkage groups of sugar beet(Beta vulgaris L.)using primary trisomics[J].Theor Appl Genet,1997,95:590-596.

[9]El-Mezawy A,Dreyer F,Jacobs G,et al.High-resolution mapping of the bolting gene B of sugar beet[J].Theor Appl Genet,2002,105:100-105.

[10]Abe J,Guan G P,Shimamoto Y.A marker-assisted analysis of bolting tendency in sugar beet(Beta vulgaris L.)[J].Euphytica,1997,94:137-144.

[11]薩姆布魯克J,弗里奇E F.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁,黎孟楓等譯.2版.北京:科學(xué)出版社,2002.

[12]戴建軍,常纓,李彩鳳,等.低溫誘導(dǎo)甜菜抽薹基因的差異表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(12):13-17.

[13]戴建軍,常纓,李彩鳳,等.低溫誘導(dǎo)甜菜（Beta vulgaris L.）抽薹相關(guān)基因的RACE分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(7):10-15.

[14]Chia T Y P,Muller A,Jung C,et al.Sugar beet contains a large CONSTANS-LIKE gene family including a CO homologue that is independent of the earlybolting(B)gene locus[J].Journal of Experimental Botany,2008,59(10):2735-2748.