通腦活絡(luò)針刺法對大鼠急性腦梗死細(xì)胞凋亡及梗死容積的影響

張臻年， 李繼英， 趙 楊， 王敬卿， 范剛啟， 黃 遲， 張 暉， 劉孔江

隨著缺血半暗帶和遲發(fā)性神經(jīng)元死亡學(xué)說的問世，人們發(fā)現(xiàn)及時抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡是減輕腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。腦缺血后，若能及時采取腦保護(hù)措施，則能抑制死亡基因的作用，加強(qiáng)存活基因的功能，因此尋找抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的干預(yù)措施將為腦缺血的治療開拓思路［1］。然而目前的抗凋亡藥物多為多肽大分子，難以通過血腦屏障，又有較大副作用，而傳統(tǒng)的針刺方法具有雙向調(diào)節(jié)作用，安全性較高。南京市中醫(yī)院腦病科曾于2003年采用通腦活絡(luò)針刺療法對急性腦梗死做過臨床和實驗研究，取得較好療效［2］，2006年1月～2009年10月，我們聯(lián)合江蘇省10家三甲級醫(yī)院采用該法治療腦梗死亦取得較好療效［3，4］，本實驗試圖從分子機(jī)制探討該法治療急性腦梗死的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組 12月齡SD大鼠，雄性，體重280～300g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號SCXK(滬)2007-0005。使用南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，實驗動物使用許可證SYXK(蘇)2007-0030。

將264只造模成功后雄性SD大鼠隨機(jī)分為11組，分別為(1):發(fā)病時間≤1.5h組共72例，其中通腦活絡(luò)針刺(針刺)組24例、溶栓組24例、體針治療(體針)組24例;(2)發(fā)病時間1.5～2h組共72例，其中通腦活絡(luò)針刺組(針刺)24例、溶栓組24例、體針治療組(體針)24例;(3)發(fā)病時間2～3h組共72例，其中通腦活絡(luò)針刺組(針刺)24例、溶栓組24例、體針治療組(體針)24例。并設(shè)缺血對照組和假手術(shù)組各24例。每組分別于24h、72h各隨機(jī)處死一批，每批為12只，隨機(jī)分為兩組，一組予TTC染色測梗死容積百分比;另一組予HE染色在光鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化，用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測凋亡細(xì)胞計數(shù)。

1.2 處理方法 通腦活絡(luò)針刺法即頭針+體針:頭針:百會、雙側(cè)風(fēng)池、人中、太陽、后頂、病灶側(cè)運動區(qū);體針:屈池、合谷、足三里、三陰交。取穴參照中國針灸學(xué)會實驗研究會1992年制定的《實驗動物穴位定位標(biāo)準(zhǔn)》，每日一次，每次留針30min，每針捻轉(zhuǎn)100轉(zhuǎn)/分，捻2次(進(jìn)針后、出針前)，各1min;溶栓:大腦中動脈梗死后在規(guī)定時間內(nèi)按10000U/Kg尿激酶在20min內(nèi)從尾靜脈緩慢注射。

1.3 試劑和藥品 四氮唑紅(TTC)由上?；瘜W(xué)試劑總廠生產(chǎn)，批號20060927;0.8%戊巴比妥鈉由上海西唐生物科技公司生產(chǎn)，批號20070302;尿激酶由天津生物化學(xué)制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格為10000U/支，批號20070505;TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 栓子制備 參考 Bednar［5］和 Sereghy［6］的方法制備栓子。在環(huán)境溫度為22℃ ～27℃下，另選健康大鼠用0.8%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，分離出股動脈、股靜脈。向股動脈刺入長10cm，外徑0.7mm的PE管(polyethylene tubing)套取動脈血。所取血樣在22℃ ～27℃下放置2h后，再放入4℃冷藏室22h，然后將血樣推入盛有生理鹽水消毒彎盤中，吸入長20cm外徑0.7mm的PE管連續(xù)反復(fù)在管中推、吸5min(約200次)后，將栓子再推入彎盤中，截成1μl栓子，最后吸入充滿生理鹽水的外徑0.35mm的PE管中，待用。

1.4.2 腦缺血動物模型建立的手術(shù)操作 在環(huán)境溫度為22℃ ～27℃下，用0.8%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。取頸正中切口切開皮膚及皮下組織，分離右側(cè)頸總動脈，充分暴露頸動脈三角、頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)及其分支，將動脈與周圍的神經(jīng)、筋膜細(xì)心游離開。燒灼斷頸外動脈各分支包括:甲狀腺上動脈、咽升動脈、枕動脈，游離ICA并牽拉開二腹肌肌腹，暴露翼腭動脈，在翼腭動脈起始處以絲線結(jié)扎。以動脈夾關(guān)閉 CCA近端、ICA遠(yuǎn)端;以絲線結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端，斷開ECA;將ECA殘段拉向ICA一致的方向，使ICA、ECA呈直線，向頸外動脈殘段內(nèi)送入已經(jīng)含有栓子和生理鹽水混懸液的外徑0.35mm的PE管，將其小心一直送入ICA內(nèi);繼而開放ICA并向ICA內(nèi)推入栓子和生理鹽水混懸液2～5μl，確定栓子已順利推入后，隨即一邊退PE管一邊再用動脈夾關(guān)閉ICA，然后拔除PE管、結(jié)扎ECA殘段根部。最后依次開放CCA、ICA的動脈夾;記錄栓塞時間。生理鹽水沖洗局部后全層連續(xù)縫合切口。假手術(shù)組不推入栓子，而僅推入5μl生理鹽水。

1.4.3 根據(jù)典型表現(xiàn)判斷模型是否成功 典型神經(jīng)癥狀表現(xiàn)為精神萎靡，同側(cè)霍納氏癥，對側(cè)前肢下垂，內(nèi)收內(nèi)旋，并自發(fā)性向患側(cè)轉(zhuǎn)圈。術(shù)后觀察癥狀，1～2h內(nèi)有典型神經(jīng)癥狀出現(xiàn)則為造模成功;2h內(nèi)無典型神經(jīng)癥狀出現(xiàn)則造模失敗，將此例動物剔除。除假手術(shù)組外，所有入組大鼠均用造模成功大鼠完成。

1.5 神經(jīng)功能缺損檢測評分 按 Longa［7，8］等的方法，在栓塞后不同時間，對動物進(jìn)行5分制神經(jīng)行為學(xué)評分。標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)無神經(jīng)功能損傷，計0分;(2)不能完全伸展左前肢，提鼠尾離開地面約30cm時，左前肢表現(xiàn)為腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或兼而有之者，計1分;(3)自發(fā)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，計2分;(4)將動物置于光滑平面上，行走時向左側(cè)傾倒，或輕推肩部時即向左側(cè)傾倒，計3分;(5)不能自發(fā)行走，或意識喪失，計4分，分?jǐn)?shù)越高，動物的行為障礙越嚴(yán)重。

1.6 TUNEL法測凋亡細(xì)胞計數(shù) TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供。試劑1:酶濃縮溶液(EnzymeSolution);試劑2:標(biāo)記溶液(Lable Solution);試劑 3:轉(zhuǎn)化劑-POD(Converter-POD)、酶標(biāo)記抗熒光素抗體(即用型)。用光學(xué)顯微鏡(×400)觀察每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)目(細(xì)胞核呈深藍(lán)色者為陽性細(xì)胞)，每組隨機(jī)計數(shù)5個視野，取其均值作為本組的代表值。

1.7 腦組織梗死容積百分比測定 參考Swanson 等［9，10］方法全部存活動物均在栓塞后規(guī)定時間斷頭取腦;去除嗅部、小腦、低位腦干，取腦組織時注意觀察有無蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦組織取出后即置于-22℃低溫冰箱快速冷凍后，由前向后每隔2mm切取組織片共6片，置2%氯化-2，3-5三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中 37℃孵育20～25min，待完全顯色后置福爾馬林液固定。染色后正常組織為紅色，腦梗死組織為白色，福爾馬林液固定后6h將腦片平面置于刻度紙上，用相機(jī)照相后輸入計算機(jī)，采用Photoshop及Autocad軟件計算每片梗死面積;然后按公式V=Sd/T(S為每一腦片梗死灶面積，d為腦片厚度，T為線形放大倍數(shù))計算每一腦梗死容積，對其不顯色部分經(jīng)圖像分析系統(tǒng)處理后計算其梗死容積(mm3)，并求出同側(cè)半球的容積，求出二者容積之比即為梗死容積百分比。

1.8 組織病理學(xué)檢查 各組大鼠于術(shù)后24h、72h斷頭取腦，取視交叉至視交叉前3mm的切片，以10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗數(shù)據(jù)經(jīng)反復(fù)核查后用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間的比較用單因素方差分析;各處理組間的兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死后動物存活情況 除假手術(shù)組在規(guī)定時間內(nèi)無死亡外，其余各組均有大鼠在規(guī)定時間內(nèi)死亡。針刺組共死亡5例，其中6h死亡2例、24h死亡2例、72h死亡1例;溶栓組共死亡13例，其中6h死亡8例、24h死亡4例、72h死亡1例;體針組共死亡8例，其中6h死亡3例、24h死亡3例、72h死亡2例;缺血對照組共死亡9例，其中6h死亡4例、24h死亡3例、72h死亡2例。

2.2 各組TUNEL凋亡細(xì)胞計數(shù)表達(dá)情況(見表1) 發(fā)病≤1.5h時間窗內(nèi):針刺組、溶栓組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.814＞0.05)，兩者均優(yōu)于體針組(P ＜0.01)及缺血對照組(P ＜0.01)。發(fā)病 1.5～2h時間窗內(nèi):針刺組、溶栓組差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.291＞0.05)，兩者均優(yōu)于體針組(P ＜0.01)及缺血對照組(P＜0.01)。發(fā)病2～3h時間窗內(nèi):針刺組仍顯著優(yōu)于溶栓組、體針組及缺血對照組(P＜0.01)，但溶栓組、體針組及缺血對照組各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。24h時點、72h時點，≤1.5h針刺組、1.5～2h針刺組、2～3h針刺組及缺血對照組各組凋亡細(xì)胞計數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.3 TTC染色后各組梗死容積百分比比較(見表2) 發(fā)病≤1.5h時間窗內(nèi):針刺組、溶栓組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.494＞0.05)，兩者均優(yōu)于體針組和缺血對照組(P＜0.01)，體針組優(yōu)于缺血對照組(P ＜0.01)。發(fā)病1.5 ～2h時間窗內(nèi):針刺組、溶栓組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.553＞0.05)，兩者均優(yōu)于體針組和缺血對照組(P＜0.01)，體針組優(yōu)于缺血對照組(P=0.011＜0.05)。發(fā)病2～3h時間窗內(nèi):針刺組優(yōu)于溶栓組、體針組及缺血對照組(P＜0.01)，但溶栓組、體針組及缺血對照組各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。24h時點、72h時點，≤1.5h針刺組、1.5～2h針刺組、2～3h針刺組及缺血對照組各組梗死容積百分比比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.4 組織病理學(xué)變化 A組(≤1.5h針刺組)可見神經(jīng)纖維排列略紊亂，少量核固縮(見圖1);B組(≤1.5h溶栓組)可見神經(jīng)細(xì)胞腫脹、少量核固縮、間質(zhì)水腫、灶性出血(見圖2);C組(≤1.5h體針組)壞死較A組明顯，神經(jīng)細(xì)胞顯著減少，核固縮(見圖3);D組(1.5～2h針刺組)可見小灶性壞死，神經(jīng)膠質(zhì)增生，排列紊亂(見圖4);E組(1.5～2h溶栓組)可見局部壞死伴少量出血及炎細(xì)胞浸潤，神經(jīng)纖維疏松，神經(jīng)膠質(zhì)增生，排列紊亂(見圖5);F組(1.5～2h體針組)可見壞死較C組明顯，神經(jīng)細(xì)胞顯著減少，核固縮(見圖6);G組(2～3h針刺組)可見壞死較A、D組明顯并伴中等炎細(xì)胞浸潤(見圖7);H組(2～3h溶栓組)神經(jīng)細(xì)胞腫脹，灶性壞死，伴炎細(xì)胞浸潤，少量核固縮，間質(zhì)水腫，灶性出血(見圖8);I組(2～3h體針組)壞死較C、F組明顯并伴中等炎細(xì)胞浸潤(見圖9);J組(缺血對照組)見到明顯梗死灶位于大腦皮質(zhì)及基底節(jié)區(qū)，大片壞死組織中見神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹或消失，核固縮或核膜破裂，結(jié)構(gòu)消失，均質(zhì)化改變，梗死灶周圍半暗帶區(qū)見大量炎細(xì)胞浸潤、核固縮濃染的細(xì)胞，血管內(nèi)皮腫脹(見圖10);K組(假手術(shù)組)無梗死灶，神經(jīng)元及神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，間質(zhì)致密無水腫。均在HE染色后用光學(xué)顯微鏡(×400)進(jìn)行觀察。

表1 各組TUNEL凋亡細(xì)胞計數(shù)表達(dá)觀察(±s)（個/400倍）

表1 各組TUNEL凋亡細(xì)胞計數(shù)表達(dá)觀察(±s)（個/400倍）

與同時點體針組比較*P＜0.01;與缺血對照組比較△P＜0.01;針刺組與1.5～2h亞組比較☆P ＜0.01;與2 ～3h亞組比較▲P ＜0.01;針刺與溶栓組比較★P ＜0.05

組別 例數(shù)24h 72h發(fā)病≤1.5h針刺溶栓體針發(fā)病1.5～2h針刺溶栓體針發(fā)病2～3h針刺溶栓體針缺血12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 22.38 ±2.30 21.91 ±3.44 45.57 ±2.57 35.67 ±3.34 36.08 ±4.54 49.89 ±2.38 47.33 ±1.58 55.40 ±2.14 55.91 ±2.63 56.20 ±2.97 32.31 ±4.72＊△☆▲31.76 ±4.26＊△50.50 ±2.33△45.28 ±3.54＊△▲47.31 ±2.40＊△54.96 ±2.68△53.35 ±3.36＊△★68.08 ±3.77 67.37 ±4.48 67.97 ±4.09

表2 TTC染色后各組梗死容積百分比比較(±s)(%)

表2 TTC染色后各組梗死容積百分比比較(±s)(%)

與同時點體針組比較*P＜0.01;與缺血對照組比較△P＜0.01;針刺組與1.5～2h亞組比較☆P ＜0.01;與2 ～3h亞組比較▲P ＜0.01;針刺與溶栓組比較★P ＜0.05

組別 例數(shù)24h 72h發(fā)病≤1.5h針刺溶栓體針發(fā)病1.5～2h針刺溶栓體針發(fā)病2～3h針刺溶栓體針缺血12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 10.30 ±2.31☆▲9.64 ±2.18 14.31 ±2.26 14.74 ±2.23▲13.60 ±2.37 17.39 ±2.26 17.29 ±2.38 19.64 ±2.26 21.49 ±1.54 20.55 ±2.36 12.62 ±2.35＊△☆▲11.68 ±2.26＊△20.63 ±2.37△16.54 ±2.33＊△▲15.71 ±2.29＊△25.46 ±2.55△20.59 ±2.39＊△★28.34 ±2.26 29.42 ±2.19 29.31 ±2.36

3 討論

本研究利用SD大鼠制作的大腦中動脈血栓栓塞性腦梗死動物模型對通腦活絡(luò)針刺法治療急性腦梗死的機(jī)制進(jìn)行了研究，證實了通腦活絡(luò)針刺法對急性腦梗死大鼠具有治療和腦保護(hù)作用。

通腦活絡(luò)針刺法中雙側(cè)太陽穴是額、顳、蝶骨匯集的翼點，此處是人體顱骨骨質(zhì)最薄處。后頂穴是嬰兒期后囟骨化前的位置。從風(fēng)池穴進(jìn)針，針尖對準(zhǔn)對側(cè)下眼眶，正是瞄準(zhǔn)了調(diào)節(jié)大腦前后循環(huán)的Willis’環(huán)［11］。百會位居高端，有統(tǒng)領(lǐng)百脈、平?jīng)_降逆的作用。通腦活絡(luò)針刺法的諸多穴位在顱頂形成一個立體網(wǎng)絡(luò)，我們在這些主穴上施加較強(qiáng)針感，通過循經(jīng)傳感作用，可能緩解梗死始動期血流動力學(xué)的紊亂，恢復(fù)半暗帶的血供，降低凋亡細(xì)胞計數(shù)及大鼠急性腦梗死時的梗死容積，逆轉(zhuǎn)腦梗死進(jìn)程。

腦缺血后神經(jīng)元死亡是一個極其復(fù)雜的病理過程。研究結(jié)果表明缺血后神經(jīng)元死亡主要表現(xiàn)為壞死和凋亡兩種形式，分別涉及主動和被動細(xì)胞死亡機(jī)制。在腦缺血急性期，神經(jīng)元壞死與凋亡并存，細(xì)胞壞死位于缺血中心區(qū)，細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶;而在腦缺血的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期，則以細(xì)胞凋亡為主，凋亡可能決定了最終梗死體積。TTC與完整的線粒體氧化酶系反應(yīng)，誘發(fā)產(chǎn)生深紅色、光酶脂溶性的Formazan而使正常組織染色，缺血組織的線粒體損傷，不能誘導(dǎo)染色反應(yīng)而呈白色，容易鑒別［12］。本實驗采用目前已被國內(nèi)外學(xué)者普遍采用的TTC作為梗死區(qū)域的檢測標(biāo)記［13，14］，觀察的腦梗死灶呈蒼白色與MCA支配的腦區(qū)域一致，未缺血部分呈紅色，證實模型制作成功。本實驗所觀察到針刺治療可明顯緩解和減輕腦梗死的病理過程。腦缺血區(qū)組織病理學(xué)變化如同以往作者的報道，大腦中動脈供血區(qū)的大腦皮質(zhì)和尾殼核的外側(cè)區(qū)明顯增厚，腦室擴(kuò)大，神經(jīng)元腫脹和壞死。此類變化持續(xù)到腦缺血3d，此時出現(xiàn)大量神經(jīng)元死亡，Garcia等［15］對此漸進(jìn)性的病理變化作了詳盡的觀察，并認(rèn)為這是由腦缺血發(fā)展成腦梗死的病理過程。

從上述實驗結(jié)果可以得出以下結(jié)論:(1)在有效時間窗內(nèi)(小于2h)，針刺組與溶栓組在降低梗死容積百分比、降低凋亡細(xì)胞計數(shù)方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);(2)在2～3h時間段以內(nèi)，通腦活絡(luò)針刺組對上述指標(biāo)的改善優(yōu)于缺血對照組(P＜0.05)，而溶栓組和缺血對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明通腦活絡(luò)針刺法較溶栓治療延長了治療時間窗，同時提示通腦活絡(luò)針刺療法的療效和時間窗相關(guān);(3)溶栓治療超過2h則無明顯效果，且明顯增加出血率，今后可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對大鼠溶栓時間窗進(jìn)行研究;(4)本實驗中對梗死容積百分比、凋亡細(xì)胞計數(shù)的觀察時點只設(shè)在24h、72h，若另設(shè)48h、7d為觀察時點，則更有利于觀察上述指標(biāo)的動態(tài)變化，將更為詳盡的闡釋急性腦梗死的病理生理變化;(5)今后研究的重點可進(jìn)一步擴(kuò)大針刺干預(yù)的時間至4h、5h、6h等，以進(jìn)一步為通腦活絡(luò)針刺法治療急性腦梗死的時間窗問題上提供更為詳實的實驗依據(jù);(6)通腦活絡(luò)針刺法可能通過在一定范圍內(nèi)下調(diào)凋亡細(xì)胞的表達(dá)，保護(hù)缺血再灌注損傷中的腦組織，從而達(dá)到腦缺血后神經(jīng)功能修復(fù)與重建的作用。

圖1 神經(jīng)纖維排列略紊亂，少量核固縮;圖2 神經(jīng)細(xì)胞腫脹，灶性出血;圖3 神經(jīng)細(xì)胞減少，核固縮;圖4 小灶性壞死，神經(jīng)膠質(zhì)增生;圖5 局部壞死伴少量出血

圖6 神經(jīng)細(xì)胞顯著減少，核固縮;圖7 壞死較明顯并伴中等炎細(xì)胞浸潤;圖8 灶性壞死、間質(zhì)水腫伴灶性出血;圖9 壞死明顯并伴炎細(xì)胞浸潤;圖10 大量炎細(xì)胞浸潤、核固縮

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