不同殼色菲律賓蛤仔免疫機(jī)能的比較研究

丁鑒鋒，楊霏，閆喜武，楊鳳，趙立強(qiáng)，張國(guó)范

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;2.遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023;3.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東青島266071)

在貝類生長(zhǎng)過程中，由于受自然條件、生理及遺傳等因素的影響，不同群體之間或同一群體中產(chǎn)生了殼色多態(tài)性。在對(duì)馬氏珠母貝Pinctada fucata martensi、海灣扇貝Argopecten irradians和皺紋盤鮑Haliotis discus discus的研究發(fā)現(xiàn)，這些海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類的不同殼色群體在生長(zhǎng)速度、成活率和出肉率等方面表現(xiàn)出顯著的差異性，尤其重要的是多種貝類的殼色能夠穩(wěn)定遺傳［1］。因此，將殼色作為一個(gè)明顯的表型，應(yīng)用于遺傳育種具有重要的價(jià)值。

菲律賓蛤仔Ruditapesp hilippenarum屬雙殼綱、簾蛤科、綴錦亞科、蛤仔屬，是一種廣溫、廣鹽性海水養(yǎng)殖品種，中國(guó)年產(chǎn)菲律賓蛤仔300萬t左右，約占中國(guó)貝類產(chǎn)量的30%，占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的20%，占世界貝類總產(chǎn)量的90% 以上［2］。目前，蛤仔養(yǎng)殖中存在種質(zhì)資源性狀退化、品質(zhì)下降等問題，而雜交育種是解決這些問題的一條有效途徑。菲律賓蛤仔殼色具有較高的多態(tài)性，殼色作為質(zhì)量性狀可以穩(wěn)定遺傳。閆喜武等［3-6］研究發(fā)現(xiàn):不同殼色蛤仔生長(zhǎng)速度、存活率等性狀存在顯著差異，通過雜交選育獲得了具有特定殼色特征并表現(xiàn)出良好數(shù)量性狀的蛤仔品系。

本研究中，作者通過對(duì)菲律賓蛤仔天然群體中不同殼色蛤仔相關(guān)免疫指標(biāo)進(jìn)行比較研究，旨在進(jìn)一步探討蛤仔殼色與存活率、抗病力等性狀的關(guān)系，為種質(zhì)改良提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用菲律賓蛤仔采自莊河海區(qū)，選取體質(zhì)量為 (11.34±0.81)g、體長(zhǎng)為 (39.85±0.81)mm、健康并具有鮮明殼色特征的野生菲律賓蛤仔作為研究對(duì)象，其中斑馬蛤群體 (Zb)，殼面具有斑馬條狀花紋;珍珠白群體 (Pw)，背景顏色為白色，左殼背部有一條深色放射條帶;兩道紅群體 (Tr)，殼面具有兩條紅色放射條帶;兩道白群體 (Tw)，殼面具有兩條白色放射條帶;奶牛蛤群體 (Co)，殼面具有奶牛黑白色花紋。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 從每個(gè)群體選取蛤仔40只，置于水槽中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖用海水鹽度為32，水溫為(22±1)℃。暫養(yǎng)期間，連續(xù)充氣，每天全量更換海水1次，每天投喂螺旋藻粉1次。

1.2.2 血淋巴細(xì)胞樣品的制備 試驗(yàn)開始時(shí)，從各群體中分別取樣30只，用無菌注射器 (1 mL)從菲律賓蛤仔圍心腔中抽取血淋巴200 μL，放入樣品管中 (1.5 mL)并置于冰上。將一個(gè)群體每6只蛤仔的血淋巴樣品混合后用于后續(xù)各種指標(biāo)的測(cè)定，每種指標(biāo)的測(cè)定共設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.2.3 總細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 從血淋巴混合樣品中吸取30 μL加入到等量的BFC固定液 (包含 NaCl 2%、乙酸鈣1%、甲醛4%，均為體積分?jǐn)?shù))中，固定后將樣品加到血球計(jì)數(shù)板中，在10倍光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.4 血細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定 采用Hannam等［7］的方法。取50 μL血淋巴混合樣品加入96孔酶標(biāo)板中，于4℃下孵育1 h;用100 μL貝類生理鹽水 (包含0.02 mol/L HEPES、0.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L MgSO4、0.01 mol/L KCl、0.01 mol/L CaCl2，pH 7.4)沖洗2次，洗去未黏附的血細(xì)胞;加入 50 μL中性紅染過的酵母懸液 (50×107個(gè)/mL)，于20℃下孵育30 min后，加入100 μL BFC液終止反應(yīng);多余的酵母顆粒用生理鹽水洗去，加入100 μL酸化酒精 (包含醋酸1%、酒精20%，均為體積分?jǐn)?shù))，置于酶標(biāo)儀中，讀取吸光度值OD550nm。吞噬活性表示方法:每毫克蛋白所吞噬的酵母顆粒數(shù)。

酵母標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取50 μL中性紅染色的酵母 (密度分別為 100×107、50×107、25×107、12.5×107、6.25×107個(gè)/mL)，加入等量酸化酒精，讀取吸光度值OD550nm，以酵母密度與吸光度值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 酚氧化酶 (PO)活性的測(cè)定 采用Zhang等［8］的方法并加以改進(jìn)。以L-多巴胺為底物，以胰蛋白酶為誘導(dǎo)因子。取50 μL血淋巴混合樣品加入96孔酶標(biāo)板中，分別加入50 μL CAC緩沖液(包含 0.01 mol/L二甲基胂酸鈉、0.45 mol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2·6H2O、26 mmol/L MgCl2·2H2O，pH 7.0)，混合均勻，于25℃下孵育10 min;加入100 μL L-多巴胺溶液 (將L-多巴胺溶于CAC緩沖液中配成質(zhì)量濃度為3 mg/mL的溶液)，混合均勻后置于酶標(biāo)儀中，讀取吸光度值OD490nm。酶活性定義為:在試驗(yàn)條件下，每分鐘吸光度值增加0.001為一個(gè)酶活力單位?；钚员硎痉椒?每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.2.6 溶菌酶 (LYZ)活性的測(cè)定 采用Allam等［9］的方法并加以改進(jìn)。以雞溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)，取40 μL標(biāo)準(zhǔn)品 (質(zhì)量濃度分別為40、20、10、5、2.5、1.25、0.6 mg/mL)或者血淋巴混合樣品加入96孔酶標(biāo)板中;分別向各孔中加入160 μL溶壁微球菌溶液 (細(xì)菌 OD600nm=0.4，0.06 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.4);室溫下孵育1 h，讀取吸光度值OD540nm，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血淋巴細(xì)胞的溶菌酶活性?；钚员硎痉椒?每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.2.7 亮氨酸氨基肽酶 (LAP)活性的測(cè)定 采用Oubella等［10］的方法。取 100 μL 血淋巴混合樣品加入96孔酶標(biāo)板中，再分別加入75 μL Tris-HCl緩沖液 (0.2 mol/L，pH 8.0)，混合均勻后分別加入25 μL 10 mmol/L L-亮氨酸-4-硝基苯胺(用去離子水配制，Sigma公司產(chǎn)品)，立即置于酶標(biāo)儀上，記錄20 min內(nèi)吸光度OD405nm的變化情況，每5 min讀數(shù)1次。酶活力單位定義為:以每毫克蛋白濃度改變的吸光度值0.001為一個(gè)酶活力單位?；钚员硎痉椒?每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.2.8 超氧化物歧化酶 (SOD)活性的測(cè)定 使用碧云天生物技術(shù)研究所總SOD活性檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說明書操作步驟測(cè)定血淋巴SOD活性。活性表示方法:每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.2.9 總蛋白濃度的測(cè)定 使用碧云天生物技術(shù)研究所Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，按照試劑盒說明書操作步驟測(cè)定血淋巴總蛋白濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (means±S.D.)表示，用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞總數(shù)和血細(xì)胞吞噬能力

不同殼色蛤仔血細(xì)胞總數(shù)和血細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定結(jié)果見圖1。從圖1可見:Tw群體血細(xì)胞總數(shù)要稍高于其他群體，但各群體間均無顯著差異(P＞0.05);Zb和Pw群體的血細(xì)胞吞噬能力顯著高于Co群體 (P＜0.05)，Tr和Tw群體的吞噬能力也高于Co群體，但差異不顯著 (P＞0.05)。

2.2 溶菌酶和亮氨酸氨基肽酶活性

不同殼色蛤仔血細(xì)胞LYZ和LAP活性的比較結(jié)果見圖2。從圖2可見:Tr和Tw群體蛤仔的血細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的LYZ活性，且顯著高于其他3組 (P＜0.05)，而Zb、Pw和Co群體的LYZ活性彼此均無顯著差異(P＞0.05);Zb和Pw群體的LAP活性高于其他3組，但差異不顯著 (P＞0.05)，而Tw群體的LAP活性最低，與其他群體差異均不顯著 (P＞0.05)。

圖1 不同殼色菲律賓蛤仔血細(xì)胞總數(shù)和血細(xì)胞吞噬能力的比較Fig.1 Comparison of the total hemolymph counts and phagocytic activity in hemolymph of Manila clam with different shell colours

圖2 不同殼色菲律賓蛤仔血細(xì)胞LYZ和LAP活性的比較Fig.2 Comparison of the activities of lysozyme and leucine aminopeptidase in hemolymph of Manila clam with different shell colours

2.3 酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性

不同殼色蛤仔血細(xì)胞PO和SOD活性的比較見圖3。從圖3可見:Co群體血細(xì)胞的PO活性最高，但僅顯著高于Tr群體 (P＜0.05)，Pw群體的PO活性次之，雖高于Zb、Tw、Tr群體，但差異均不顯著 (P＞0.05);Pw群體血細(xì)胞的SOD活性最高，顯著高于Tr和Co群體 (P＜0.05)，但與Zb和Tw群體差異不顯著 (P＜0.05)，Zb群體的SOD活性次之，也顯著高于Tr群體，但與Tw、Co群體差異不顯著 (P＞0.05)，Tw群體的SOD活性也較Tr和Co群體高，但差異不顯著 (P＞0.05)。

圖3 不同殼色菲律賓蛤仔血細(xì)胞PO和SOD活性的比較Fig.3 Comparison of the activities of phenoloxidase and superoxidase dismutase in hemolymph of Manila clam with different shell colours

3 討論

貝類呈現(xiàn)不同殼色的因素包括物理性和化學(xué)性兩方面?；瘜W(xué)性因素是指由色素沉積產(chǎn)生的顏色，如黑色素產(chǎn)生黑、灰、褐色，脂類色素 (包括胡蘿卜素和卟啉)則可產(chǎn)生紅、紫、黃、橙、綠等顏色。物理性因素主要是通過色素細(xì)胞上方無色且有凸凹溝紋的蠟質(zhì)層，或夾在色素間多角形無色的折光細(xì)胞，對(duì)光的折射而產(chǎn)生不同的顏色。一些軟體動(dòng)物殼表面有規(guī)律的微結(jié)構(gòu)對(duì)光干涉和衍射可呈現(xiàn)獨(dú)特的彩虹色，稱之為結(jié)構(gòu)性殼色［11］。從已有的研究來看，貝類殼色是可以遺傳的，殼色及色素沉積模式都是由簡(jiǎn)單的孟德爾遺傳基礎(chǔ)控制，但很多環(huán)境因素，如生長(zhǎng)環(huán)境的鹽度、溫度和深度，以及對(duì)攝食食物色素的被動(dòng)吸收等均影響殼色的選擇，在不同群體之間或同一群體中產(chǎn)生殼色多態(tài)性。如泥螺Batillaria attramentaria殼色的多態(tài)性與潮汐和環(huán)境溫度變化有關(guān)［12］;而對(duì)濱螺 Littorina obtusata和Littorina saxatilis的相關(guān)研究也表明，環(huán)境溫度和水環(huán)境鹽度對(duì)殼色顯型的選擇均具有較高的貢獻(xiàn)［13-16］，皺紋盤鮑殼色除受遺傳基因控制外，還受到食物成分的影響［17］。

貝類的免疫能力同樣會(huì)受環(huán)境因子如溫度、鹽度、溶氧、食物和污染物等影響［18-21］。環(huán)境溫度升高能夠抑制櫛孔扇貝Chlamys farreri和海灣扇貝的免疫能力，從而導(dǎo)致其大規(guī)模死亡;將雜色鮑Haliotis diversicolor supertexta從28℃的水中轉(zhuǎn)移到32℃的水中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其免疫能力降低，從而更易受到弧菌Vibrio parahaemolyticus的感染［22-24］;對(duì)雞簾蛤Chamelea gallina的研究發(fā)現(xiàn)，溫度超過25℃時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生不利的影響，而溫度超過30℃時(shí)其免疫能力受到明顯的抑制，此時(shí)受病原感染的幾率會(huì)大大增加［25］。Lambert等［26］通過對(duì)比夏季高溫期低死亡率和高死亡率的太平洋牡蠣Crassostrea gigas家系發(fā)現(xiàn)，牡蠣的血細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、呼吸爆發(fā)能力以及對(duì)病原弧菌的易感性等免疫因子由遺傳控制，受到環(huán)境因素的影響，并可決定個(gè)體在夏季的存活能力。對(duì)太平洋牡蠣［19］、貽貝Mytilus galloprovincialis等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，鹽度升高和降低都會(huì)影響貝類的免疫能力。Soudant等［28］研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)變化以及養(yǎng)殖環(huán)境能夠影響菲律賓蛤仔的生理和免疫參數(shù)，并且與蛤仔褐環(huán)斑病(Brown ring disease)的流行性有關(guān)。

環(huán)境因子對(duì)貝類殼色和免疫能力都具有選擇性，而適應(yīng)性是自然選擇的結(jié)果，只有那些有適應(yīng)意義的性狀才在進(jìn)化中被保留下來，因此，貝類殼色和免疫能力之間可能具有某種相關(guān)性。相關(guān)的研究結(jié)果也提供了一些間接證據(jù):Brand等［29］研究發(fā)現(xiàn):一些殼色的扇貝個(gè)體在發(fā)育的某一階段急劇減少，原因可能是由于這一殼色的個(gè)體虛弱，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較低而被淘汰;Bauchau［27］的假說認(rèn)為，貝類生長(zhǎng)是受神經(jīng)調(diào)控，貝殼色素作為一種穩(wěn)定的信號(hào)標(biāo)記能夠被神經(jīng)末梢識(shí)別，并且神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)不同色素的識(shí)別能力不同，色素分布的形狀能夠調(diào)節(jié)貝殼生長(zhǎng)過程以獲得最佳的結(jié)構(gòu) (如雙殼類貝殼的對(duì)稱性)，而對(duì)稱性是動(dòng)物發(fā)育穩(wěn)定的一種標(biāo)志，因此，色素結(jié)構(gòu)可能是影響貝類發(fā)育穩(wěn)定性的一種機(jī)制。有研究［30-31］發(fā)現(xiàn)，發(fā)育穩(wěn)定的個(gè)體都具有較好的對(duì)稱性，并且免疫能力和繁殖力都要遠(yuǎn)高于不對(duì)稱的個(gè)體。因此，不同貝類的殼色可能會(huì)通過調(diào)節(jié)貝類的發(fā)育過程影響其免疫能力。閆喜武等［3-6］對(duì)菲律賓蛤仔的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，斑馬蛤和瑪瑙黑等殼色群體的子代比兩道紅群體具有更高的成活率和更強(qiáng)的抗逆性。本研究中發(fā)現(xiàn)，斑馬蛤的血細(xì)胞吞噬能力、PO、LAP和SOD活性均高于兩道紅，這些參數(shù)的差異可能與蛤仔的殼色之間有一定相關(guān)性。

一些分子生物學(xué)的研究結(jié)果也表明殼色與免疫能力之間可能有一定的相關(guān)性，Jackson等［32］研究發(fā)現(xiàn)，Has-sometsuke的轉(zhuǎn)錄物主要形成一些殼上的藍(lán)色和紅色斑點(diǎn)，表明基因表達(dá)與貝殼的結(jié)構(gòu)之間有直接關(guān)系，這種基因表達(dá)與殼色的關(guān)聯(lián)性為進(jìn)一步研究形成殼結(jié)構(gòu)和殼色的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。Kinoshita等［33］對(duì)珍珠貝Pinctada fucata外套膜和珍珠囊中殼形成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)多種編碼凝集素、蛋白酶、蛋白酶抑制因子等的基因序列;Wang等［34］研究發(fā)現(xiàn)，皺紋盤鮑體內(nèi)編碼殼形成蛋白perlucin的基因具有典型的C型凝集素結(jié)構(gòu);Nagai等［35］在合浦珠母貝Pinctada fucata體內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩種與殼黑色素形成相關(guān)的基因—Pfty1和Pfty2，其編碼的蛋白可能具有酚氧化酶的活性，這些研究表明，貝類體內(nèi)的多種免疫基因可能參與貝殼及殼色的形成過程。Guan等［36］采用抑制性消減雜交技術(shù)對(duì)馬氏珠母貝紅殼色和非紅殼色個(gè)體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因的表達(dá)可能與紅殼色家系殼色多樣性有關(guān)。因此，貝類的殼色可能受多個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制。最新的研究表明，同一基因在不同生物學(xué)通路的權(quán)重可以不同［37］，本研究中采用的蛤仔免疫指標(biāo)受不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控［38］，所表現(xiàn)出的差異性是否與殼色決定基因在不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所發(fā)揮的作用不同有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

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