泡核桃殼提取物體外抗菌實(shí)驗(yàn)的初步研究

張海珠，馬 媛，周 萍

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

泡核桃（Juglans sigillata）又名漾濞核桃、茶核桃、鐵核桃，系胡桃科（ Juglandaceae）胡桃屬（ Juglans）植物。種植較廣泛，主要分布于云南〔1〕、貴州、四川西部等，生長于海拔1300～3300 m山坡或山谷林中〔2〕。核桃取仁后的副產(chǎn)物即為核桃殼，其質(zhì)地堅(jiān)硬，常被作為廢物棄掉或焚燒，造成了資源的極大浪費(fèi)，其利用價值極低。為使這一生物資源得到有效利用，學(xué)者們從多方面對它的應(yīng)用價值進(jìn)行研究，取得了一定成果，如制造活性炭〔3-5〕、作為新能源燃料〔6〕、制造眼鏡、手表等零件的清洗和拋光材料〔7〕、作為濾料、堵漏材料、有機(jī)稀釋肥、抗聚劑〔8〕、催化熱解制取氫氣〔9〕、制備木材膠粘劑〔10〕、制造顆粒填充聚氯乙烯基復(fù)合材料可改善材料的隔聲性能〔11〕等應(yīng)用。并發(fā)現(xiàn)核桃殼具有一定的藥理作用，如提取物對心肌缺血有保護(hù)作用〔12〕、木醋液有抑菌作用〔13〕等。本實(shí)驗(yàn)對核桃殼的提取物HTKD、HTKE、HTKF對常見致病菌的抑制作用進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，并測定了它們的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），以期進(jìn)一步開發(fā)核桃殼的藥用價值，拓展其應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），電熱恒溫培養(yǎng)箱（蕭山永發(fā)電器有限公司滬南實(shí)驗(yàn)儀器廠），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司、上海-恒科學(xué)儀器有限公司），SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試藥 MH（A）培養(yǎng)基、MH（B）、沙氏瓊脂培養(yǎng)基、液體沙氏瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂粉等均由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌均由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物教研室提供。泡核桃采集自云南省大理州漾濞縣，由大理學(xué)院生藥學(xué)教研室周濃副教授鑒定為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）植物泡核桃（ Juglans sigillata）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 泡核桃提取物原液的配制 泡核桃殼經(jīng)10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸調(diào)pH為中性，加2、4、6倍乙醇沉淀得到HTKD、HTKE、HTKF提取物。精密稱取HTKD、HTKE、HTKF組分，用蒸餾水溶解，配制成濃度為250 mg/mL、333.3 mg/mL、200 mg/mL的藥物原液，滅菌后備用。

2.2 供試菌混懸液的制備 將6種細(xì)菌菌落（遵循少量多次的原則）置于約2 mL生理鹽水中，混勻，與0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葘?，相同后用液體肉湯/沙氏培養(yǎng)基稀釋3次，使含菌量約為0.5×106CFU/mL，作為供試菌混懸液。

2.3 核桃殼提取物MIC和MBC的測定〔14〕

2.3.1 MIC的測定 將三種組分藥物原液用試管稀釋法進(jìn)行倍比稀釋為10管，過濾后，按濃度從低到高的順序依次吸取100 μL加入到96孔板的相應(yīng)孔中，再向此些孔中加入100 μL菌液（濃度為0.5×106CFU/mL），置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h〔15〕。 板中可用肉眼觀察到有渾濁的孔表示有細(xì)菌生長，每行最后一個澄清的孔中的藥物稀釋濃度即為該藥物的MIC。

2.3.2 MBC的測定 取MIC測定中無細(xì)菌生長孔中的混合液各100 μL注入瓊脂培養(yǎng)基，用涂布法展開，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以菌落數(shù)不超過5個的平板所對應(yīng)的小試管的最低藥物濃度為該藥物的最低殺菌濃度（MBC）。

2.4 對照實(shí)驗(yàn) 空白對照：200 μL液體培養(yǎng)基，藥液和菌液均不加；陰性對照：液體培養(yǎng)基100 μL加稀釋后最小濃度的藥液100 μL，不加菌液；陽性對照：液體培養(yǎng)基100 μL，加相應(yīng)的菌液100 μL，不加藥液。

3 結(jié)果

3.1 核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分的抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （ 表1～3）

表1 核桃殼HTKD組分的抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 核桃殼HTKE組分的抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 核桃殼HTKF組分的抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分的MIC及MBC （表4～5）

表4 核桃殼提取物對8種細(xì)菌的MIC

表5 核桃殼提取物對8種細(xì)菌的MBC

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用微量稀釋法進(jìn)行泡核桃殼提取物HTKD、HTKE、HTKF組分進(jìn)行MIC、MBC的測定，對了解泡核桃殼提取物有無抗菌作用、抗菌效果如何、確定用藥劑量和研究抗菌機(jī)理等方面具有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明泡核桃殼HTKD、HTKE、HTKF三種組分對綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、白色念珠菌等8種臨床常見致病菌均有一定的抑制或殺滅作用。雖然此實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)了一定的結(jié)果，但是體外抗菌實(shí)驗(yàn)的環(huán)境與體內(nèi)不同，所以這些提取物還需要進(jìn)一步通過動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證明其抗菌作用，進(jìn)而為開發(fā)核桃殼的抗菌藥用價值奠定基礎(chǔ)。

近年來，不合理使用抗生素導(dǎo)致耐藥菌逐漸增多，這些細(xì)菌的感染嚴(yán)重威脅人類的健康。但細(xì)菌較少對抗菌中藥產(chǎn)生耐藥，研究和開發(fā)抗菌中藥對解決耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生具有重要意義〔16〕。本實(shí)驗(yàn)研究的泡核桃殼具有來源廣泛、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，對其進(jìn)行抗菌成分及機(jī)理的研究，通過建立動物模型，設(shè)定客觀的評價標(biāo)準(zhǔn)，為其今后在臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

〔1〕黃俊杰，柏斌.大理核桃基地面積達(dá)35萬公頃〔J〕.中國果業(yè)信息，2009，26（ 8）：48.

〔2〕中國科學(xué)院中國植物志編委會.中國植物志〔M〕.1版.北京：科學(xué)出版社，1979：31-32.

〔3〕汪文祥，公偉偉，高朋召.源于核桃殼的生物形態(tài)多孔炭的制備及其性能研究〔J〕.陶瓷學(xué)報，2010，31（ 3）：463-467.

〔4〕信欣，何歆，崔鈳，等.核桃殼炭化吸附廢水中Cr（Ⅵ）的性能研究〔J〕.環(huán)境工程學(xué)報，2010，4（ 10）：2273-2277.

〔5〕李秀玲，趙朝成.核桃殼質(zhì)活性炭的制備及吸附惡臭氣體的研究〔J〕.環(huán)境科技，2009，22（ 6）：32-34.

〔6〕金曼.低碳經(jīng)濟(jì)背景下山核桃殼炭的推廣利用〔J〕.科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2010，36：72.

〔7〕馬玉蘭.淺論核桃的使用價值〔J〕.青海農(nóng)牧業(yè)，2007，1（ 89）：36.

〔8〕張利波，彭金輝，范興祥，等.核桃殼綜合利用技術(shù)的現(xiàn)狀〔J〕.化工通訊，2003，37（ 2）：21-25.

〔9〕張蕾，張磊，舒新前，等.核桃殼催化熱解制取氫氣〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報：工學(xué)版，2008，38（ 2）：287-291.

〔10〕鄭志峰，鄒局春，劉本安，等.核桃殼液化產(chǎn)物制備木材膠粘劑的研究〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報，2007，28（ 4）：1-3.

〔11〕俞未明，朱春燕，高磊，等.核桃殼顆粒填充聚氯乙烯基復(fù)合材料的隔聲性能〔J〕.浙江理工大學(xué)學(xué)報，2008，25（ 5）：497-501.

〔12〕王維亭，趙專友，周則衛(wèi)，等.核桃殼提取物對大鼠急性心肌缺血作用的影響〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（ 5）：386-388.

〔13〕尉芹，馬希漢，鄭滔.核桃殼木醋液的制取、成分分析及抑菌試驗(yàn)〔J〕.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2008，24（ 7）：276-279.

〔14〕徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1658.

〔15〕范青生，馬振亞.防腐抑菌中藥的微量快速篩選法研究及其應(yīng)用〔J〕.微生物學(xué)通報，1991，18（ 2）：114-117.

〔16〕喬海霞，甄攀，李秀娟，等.吳茱萸提取物體外抗菌作用初步研究〔J〕.河北北方學(xué)院學(xué)報，2009，26（ 1）：27-29.