CCI模型大鼠疼痛行為學(xué)觀察

馮昌盛 余慶波 楊丹 涂發(fā)平

疼痛是人們一生中經(jīng)常遇到的不愉快感覺，它提供軀體受到威脅的警報信號，是生命不可缺少的一種特殊保護(hù)功能。另一方面，它又是各種疾病最常見的癥狀，也是當(dāng)今困擾人類健康最嚴(yán)重的問題之一。根據(jù)神經(jīng)生理功能，疼痛可分為生理性疼痛和病理性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或異常引起的一種難以治療的疼痛狀態(tài)。CCI模型是最常用的神經(jīng)病理性疼痛動物模型。本研究主要觀察CCI模型大鼠疼痛行為學(xué)表現(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠，6～8周齡，雄性，體重180～200 g，購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境安靜，有良好的通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng)，室溫22 ℃左右，濕度50%左右，明暗光照12 h:12 h，自由攝食，隔日更換籠具和墊料。動物適應(yīng)環(huán)境3 d。雄性SD大鼠(n=48只)隨機(jī)分為三組，即正常對照組(Nave組：n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)、假手術(shù)組(Sham組：n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)以及CCI組(n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)。

1.2 CCI模型的建立 (1)按Bennet和Xie[1]方法制作CCI模型；(2)稱重：采用腹腔給藥10%水合氯醛麻醉，300～500 mg/kg。側(cè)臥位，手術(shù)側(cè)在上，消毒，鋪巾，選擇左后肢，在股骨下方約l cm平行于股骨切開皮膚，用小剝離子經(jīng)股二頭肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用神經(jīng)剝離子輕柔將坐骨神經(jīng)與周圍軟組織分離；(3)在坐骨神經(jīng)分成三支前的主干部位游離神經(jīng)7 mm左右，在距神經(jīng)起始處(三支分叉處)上方2 mm處，用4.0含鉻羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm，使被結(jié)扎的神經(jīng)長約4～5 mm。注意結(jié)扎的松緊度，以打結(jié)時可見肌肉輕微抽動為準(zhǔn)；(4)局部生理鹽水沖洗，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚；術(shù)畢將大鼠放入鼠籠，于溫暖、安靜環(huán)境自由喂養(yǎng)；(5)假手術(shù)組除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)外，其余同模型組；手術(shù)由同一人操作。

1.3 行為學(xué)觀察 在手術(shù)后2周內(nèi)，每隔1～2 d觀察1次，包括大鼠的步態(tài)和左后肢的姿勢、局部皮膚以及肌肉張力的改變程度、是否存在舔咬肢體現(xiàn)象等。

1.4 機(jī)械刺激傷害感受閾值(MWT)的測量 在安靜的環(huán)境中，將大鼠單獨(dú)放置于透明的有機(jī)玻璃體中，待大鼠適應(yīng)環(huán)境15～30 min后，以Electronic von Frey刺激針刺激大鼠左、右足底，每只大鼠刺激3次，間隔大于10 s。大鼠會出現(xiàn)抬足、縮足、快速甩足以及甩足后舔足等反應(yīng)。將3次讀數(shù)取平均值作為機(jī)械縮足反射閾值(MWT)。各組于術(shù)前、術(shù)后第1、3、6、8、10、13天進(jìn)行測量。測量時間固定為9:00～13:00。術(shù)前測定值為基礎(chǔ)機(jī)械痛閾。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以(±s)表示，兩組樣本均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，組間比較采用重復(fù)資料方差分析和post hoc檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)變化 CCI大鼠術(shù)后健康狀況良好，體重?zé)o明顯減輕，毛發(fā)富有光澤，覓食飲水基本正常。術(shù)后1～2周，手術(shù)足趾并攏輕度外翻，下肢行走無力，步態(tài)呈現(xiàn)跛行，經(jīng)常左后足懸空或不敢著地；站立時以右后肢持重，左后肢抬起并緊貼于腹部；術(shù)后14 d左右，左后肢出現(xiàn)比較明顯的肌肉萎縮，給予輕微von Frey刺激時，大鼠經(jīng)常迅速將左后肢抬起，有時放入口中舔吮；CCI大鼠左后肢懸空時間常超過25 s，CCI大鼠無自噬肢體現(xiàn)象。

2.2 大鼠體重變化 CCI組大鼠術(shù)后健康狀況良好，體重?zé)o明顯減輕，但體重增長較Sham組和Nave組略慢。各組大鼠術(shù)前基礎(chǔ)值、術(shù)后第1、3天體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在術(shù)后第6、8、10、13天，CCI組大鼠體重與Nave組、Sham組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)前、術(shù)后Nave組大鼠體重與Sham組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 CCI模型大鼠體重變化(±s)g

表1 CCI模型大鼠體重變化(±s)g

*CCI組與Nave組、Sham組比較，P<0.05

組別 D0 D1 D3 D6 D8 D10 D13 Naimages/BZ_6_1866_491_1881_534.pngve組 Naimages/BZ_6_1866_491_1881_534.pngve7(n=8) 213±7.56 226.17±3.71 247.17±5.27 262.33±4.27 Na images/BZ_6_1866_491_1881_534.pngve14(n=8) 211.17±5.88 225.5±2.26 242.83±4.07 258.17±5.88 268.17±47.9 284±9.25 310±11 Sham 組 Sham7(n=8) 230.83±15.13 229.17±14.32 244.17±18.84 253.83±17.78 Sham14(n=8) 220.5±12.85 218.5±12.53 17.83±15.14 237.83±18.06 253.17±17.23 276±15.89 299.33±18.86 CCI組 CCI7(n=8) 218.2±5.97 217.4±5.55 231±15.3 242.8±15.16*CCI14(n=8) 215±11.79 208.6±11.55 218±8.4 233.6±12.01* 251.8±14.13* 269.6±9.29* 295.4±8.41*

2.3 機(jī)械刺激傷害感受閾(MWT)變化 各組大鼠術(shù)前機(jī)械性痛閾比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。手術(shù)前、后Nave組大鼠痛閾與Sham組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠非術(shù)側(cè)機(jī)械性痛閾比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CCI組大鼠術(shù)側(cè)痛閾在手術(shù)后第3、6、8、10、13天明顯低于非手術(shù)側(cè)，亦明顯低于Sham組和Nave組(P<0.05)。CCI組大鼠術(shù)側(cè)痛閾在手術(shù)后第6天降低最明顯，此后一直保持此趨勢至術(shù)后第13天，見表2。

表2 CCI模型大鼠機(jī)械刺激傷害感受閾變化(±s) g

表2 CCI模型大鼠機(jī)械刺激傷害感受閾變化(±s) g

L：左足，R：右足，DX：*術(shù)后第X天CCI組與Nave組、Sham組比較，P<0.05

組別 足 D0 D3 D6 D8 D10 D13 Naimages/BZ_6_1866_491_1881_534.pngve7(n=8) L 56.57±2.85 57.05±3.24 57.85±1.65 R 55.42±2.87 56.33±2.12 57.18±1.76 Naimages/BZ_6_1866_491_1881_534.pngve14(n=8) L 56.06±2.32 55.81±2.41 55.34±2.76 55.2±3.29 56.23±3.03 56.04±2.87 R 55.89±2.64 54.34±2.43 53.63±2.59 56.38±2.72 55.43±3.31 56.09±2.54 Sham7(n=8) L 57.45±2.77 56.4±2.29 53.97±2.76 R 55.38±2.77 55.95±3.45 57.08±2.57 Sham14(n=8) L 55.71±2.68 56.8±1.97 55.29±2.76 57.26±2.38 55.44±3.26 55.51±2.51 R 56.33±2.15 55.75±2.73 54.45±3.1 57.33±1.93 55.85±2.76 54.39±2.74 CCI7(n=8) L 56.24±2.74 22.37±2.45* 16.84±1.64*R 55.65±2.7 55.55±2.99 56.38±2.27 CCI14(n=8) L 54.35±2.71 23.51±3.07* 18.16±1.51* 15.1±2.4* 14.7±2.37* 14.58±2.34*R 54.2±3.24 55.19±3.29 4.89±3.59 56.96±1.93 56.18±3 54.61±3.01

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛的研究大多來源于動物模型，盡管目前模型還存在不少缺陷，但是它為理解和探索人類神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制提供了有用的工具。病理性疼痛按其病程可分為急性和慢性兩大類。前者多由損傷或炎癥反應(yīng)所致，當(dāng)損傷痊愈或炎癥消失時，疼痛即可消除。后者則多由難以消除的慢性炎癥或神經(jīng)病變所致，病程常遷延很久。慢性病理性疼痛模型主要分為兩大類：炎癥性及神經(jīng)源性[1-2]。神經(jīng)病理性疼痛的病理機(jī)制比較復(fù)雜，病變部位可從外周感受器一直到腦。神經(jīng)病理性疼痛一般均伴有血管功能異常及炎癥征象[3]。急性神經(jīng)病理性疼痛患者由于患肢交感縮血管神經(jīng)節(jié)后纖維神經(jīng)遞質(zhì)釋放量下降，引起表皮交感縮血管神經(jīng)興奮性功能喪失[4]。Bennett和xie于1988年首次復(fù)制出CCI模型，是國際上應(yīng)用較多的疼痛模型。該模型操作簡單，易掌握。該模型術(shù)后第2天開始出現(xiàn)痛反應(yīng)，10～14 d達(dá)高峰，持續(xù)2個月后痛反應(yīng)消失[1]。本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與上述理論相符。

CCI大鼠疼痛模型表現(xiàn)為自發(fā)痛(自發(fā)抬起損傷肢體，時而舔足、咬足或甩足，避免損傷側(cè)的負(fù)重)、痛覺過敏(機(jī)械痛敏和冷痛敏)、輕度或中度的自殘現(xiàn)象。多用于腫瘤壓迫、重金屬離子中毒、缺氧或代謝異常等誘發(fā)的神經(jīng)病性慢性痛的研究[5]。由于鉻腸線結(jié)扎之松緊度完全取決于實(shí)驗(yàn)操作，不同的松緊度可能導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)纖維功能的喪失，因此，來自于受損坐骨神經(jīng)向脊髓節(jié)段的傳入沖動可能存在差異。CCI模型的機(jī)制主要是由于機(jī)械壓迫使軸突損傷并引起異位放電，并且用含鉻腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)后，局部重金屬鉻對神經(jīng)的化學(xué)作用使炎癥介質(zhì)釋放。大約在術(shù)后2周，神經(jīng)損傷區(qū)域遠(yuǎn)端的有髓鞘纖維幾乎全部脫髓鞘，但無髓鞘C纖維保持完整，損傷區(qū)域近端神經(jīng)纖維正常[6]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CCI模型大鼠非手術(shù)側(cè)(右側(cè))在術(shù)前、術(shù)后無顯著變化，說明未發(fā)生超敏反應(yīng)，無“鏡像”痛發(fā)生。CCI大鼠行為學(xué)的改變及痛閾指標(biāo)的變化有一定聯(lián)系，與經(jīng)典文獻(xiàn)報道相符，說明模型建立成功，為進(jìn)一步的深入研究奠定了良好基礎(chǔ)。

[1] Bennett G J，Xie Y K.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J].Pain，1988，33(1):87-107.

[2] Bellavance L L，Beitz A J，Anwyl.Altered e-fos expression in the parabrachial nucleus in rodent model of CFA·induced peripheral inflammation[J].J Comp Neuron，1996，366(3):431-447.

[3] Muenter Swift N，Charkoudian N，Dotson R M，et a1.Baroreflex control of muscle sympathetic nerve activity in postural orthostatic tachycardia syndrome[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(3):1226-1233.

[4] Wasner G，Schattschneider J，Binder A，et a1.Complex regional pain syndrome-diagnostic，mechanisms，CNS involvement and therapy[J].Spinal Cord，2003，41(2):61-75.

[5] Attal N，Jazat F，Kayser V.Further evidence for “pain related”behaviors in a model of unilateral peripheral mononeuropathy[J].Pain，1990，41(2):235-251.

[6] Mosconi T'Kruger L.Fixed-diameter polyethelene cuffs applied to the rat sciatic nerve induce a painful neuropathy:ultrastruetrual morphometric analysis of axonal alterations[J].Pain，1996，64(1)：37-57.