文心蘭原球莖生長(zhǎng)和分化過程中酶活性和可溶性蛋白的變化

尤海波

（黑龍江省農(nóng)科院園藝分院，哈爾濱150069）

在離體培養(yǎng)過程中，自Galston等［9］1969年最早研究煙草髓部愈傷組織的分化與過氧化物同工酶的關(guān)系以來，人們?cè)谶@一領(lǐng)域進(jìn)行了許多研究，發(fā)現(xiàn)外植體的生長(zhǎng)、脫分化、分化與過氧化物酶活性、可溶性蛋白含 量 及其 同 工 酶 等 的 變 化 有 關(guān)［5－6，8，12］。 但 是 這 些 研 究主要集中于器官發(fā)生途徑和體胚發(fā)生途徑。原球莖（Protocorm－like bodies，簡(jiǎn)稱PLBs）作為蘭科植物的一種特殊再生方式，在其形態(tài)發(fā)生過程中以上物質(zhì)必然有其特定的代謝與變化規(guī)律。本試驗(yàn)研究了文心蘭原球莖分化芽和根系過程中抗壞血酸過氧化物酶（APX）、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）活性以及可溶性蛋白含量的變化，為研究原球莖的生長(zhǎng)或分化機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與處理

黑龍江省農(nóng)科院園藝分院組織培養(yǎng)中心培養(yǎng)的文心蘭（Dendrobium officinale）原球莖，經(jīng)兩次繼代培養(yǎng)達(dá)到生長(zhǎng)旺盛狀態(tài)時(shí)，再挑選處于同一生長(zhǎng)時(shí)期、沒有分化的原球莖轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基1／2MS＋BA5＋NAA 0.3，每瓶均轉(zhuǎn)入上述原球莖10g，每個(gè)處理各5瓶。培養(yǎng)基pH5.6～5.8，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，每日光照12 h，光照強(qiáng)度1600～2500lx，分別與接種后的0d、7d、14d、21d、28d取樣，進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定（每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶液制備及酶活性測(cè)定。分別準(zhǔn)確稱取不同生長(zhǎng)時(shí)期的原球莖及不定芽新鮮材料0.3g，冰浴研磨，加入 PBS（pH7.8）緩沖液1.6mL，充分混勻，12000r／min離心30min，立即取上清液測(cè)定?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G－250比色法［7］；POD活性測(cè)定采用氧化愈創(chuàng)木酚法［2］，以每分鐘每單位質(zhì)量吸光度值的變化表示（ΔOD·mg－1FW·min－1）；CAT活性采用過氧化氫氧化法測(cè)定［2］，以每分鐘OD值減少0.01為一個(gè)酶活性單位（U·g－1FW·min－1）；SOD活性測(cè)定采用 NBT光還原法［2］，以抑制NBT光化還原50%的酶量為一個(gè)酶活性單位（U·g－1FW）。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 可溶性糖含量測(cè)定。分別準(zhǔn)確稱取不同發(fā)生時(shí)期的原球莖及不定芽的新鮮材料0.3g，剪碎，放入20mL刻度試管中，加5mL去離子水，管口封膜，沸水浴10min，流水冷卻，過濾至25mL容量瓶中，反復(fù)漂洗殘?jiān)霸嚬埽麴s水定容至刻度。采用蒽酮比色法［2］測(cè)定可溶性糖含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭原球莖不同發(fā)育時(shí)期酶活性變化

圖1 文心蘭原球莖不同發(fā)育時(shí)期APX變化

圖2 文心蘭原球莖不同發(fā)育時(shí)期POD活性變化

圖3 文心蘭原球莖不同發(fā)育時(shí)期CAT活性變化

圖4 文心蘭原球莖不同發(fā)育時(shí)期SOD活性變化

如圖1～圖4所示，在原球莖分化芽的過程中，APX、POD的活性均急劇下降，隨著芽的繼續(xù)生長(zhǎng)，APX和POD的活性繼續(xù)降低；根系一旦被誘導(dǎo)，又呈上升趨勢(shì)，但活性均低于類原球莖期的水平；而CAT的活性在PLB分化芽后降到最低水平，隨著芽的生長(zhǎng)活性緩慢升高，在根分化完成后活性再略有升高，變化趨勢(shì)與APX和POD大致相同。SOD與APX、POD、CAT的活性變化則呈現(xiàn)完全相反的變化趨勢(shì)。在類原球莖時(shí)期處于相對(duì)較高的水平，芽的分化伴隨SOD活性的增強(qiáng)，但隨根的分化和生長(zhǎng)，活性呈現(xiàn)接近直線降低的趨勢(shì)，在根繼續(xù)生長(zhǎng)時(shí)，SOD的活性接近于0。

2.2 多酚氧化酶（PPO）活性的變化

如圖5所示，在類原球莖分化芽的過程中，PPO的活性呈明顯的下降趨勢(shì)。在芽不斷生長(zhǎng)的過程中，活性繼續(xù)降低，生根前降到最低，生根后活性回升，且隨根系伸長(zhǎng)，酶活性繼續(xù)增強(qiáng)。

圖5 文心蘭原球莖不同生長(zhǎng)時(shí)期PPO活性的變化

2.3 可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量變化

圖6 文心蘭原球莖不同生長(zhǎng)階段可溶性糖含量的變化

圖7 文心蘭原球莖不同生長(zhǎng)階段可溶性蛋白含量的變化

圖6顯示，文心蘭原球莖可溶性糖含量在其發(fā)生過程中總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，并在根生成時(shí)達(dá)到最大值，文心蘭原球莖可溶性糖在芽和根的分化時(shí)期累積較多，并在根生長(zhǎng)期出現(xiàn)最大峰值，這為細(xì)胞連續(xù)分裂和發(fā)育提供了物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，也為原球莖分化為幼苗提供物質(zhì)和能量?jī)?chǔ)備。

由圖7可知，在文心蘭原球莖發(fā)生過程中，其可溶性蛋白質(zhì)含量芽分化期急劇增加，在根形成期達(dá)到最大值。芽生長(zhǎng)期和根形成期的可溶性蛋白質(zhì)含量差異不顯著。從整個(gè)培養(yǎng)過程來看，芽和根形成期可溶性蛋白質(zhì)含量急劇升高，這表明在原球莖分化初期，原球莖需要合成大量蛋白質(zhì)來啟動(dòng)芽的發(fā)生；而根形成期可溶性蛋白質(zhì)累積較多，這為苗的進(jìn)一步發(fā)育提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論

原球莖是許多蘭科花卉最重要的離體無性繁殖的中間體，對(duì)其生長(zhǎng)和分化的調(diào)控是蘭花試管無性繁殖研究的重要內(nèi)容。已有的大量研究均是圍繞著外部因子，如培養(yǎng)基的成分和激素組合等開展，而對(duì)原球莖整個(gè)生長(zhǎng)和分化過程中內(nèi)在的生理生化變化的研究卻未見有系統(tǒng)的報(bào)道。

本試驗(yàn)表明，原球莖分化芽的過程中，APX、POD、CAT和PPO的活性均呈急劇下降，在根發(fā)生后逐漸回升。劉玉艷等研究表明［3］，POD和PPO活性下降直接或間接調(diào)控IAA的水平，促進(jìn)根原基的發(fā)生；而根原基發(fā)生后POD和PPO的活性又有所提高，可能與生根輔助因子“IAA－酚酸復(fù)合物”的產(chǎn)生、H2O2參與細(xì)胞壁形成、木質(zhì)素單體的聚合有關(guān)。由于POD和PPO的活性變化均早于根的形態(tài)發(fā)生，一方面說明根發(fā)生的生理生化變化先于形態(tài)發(fā)生，另一方面也證實(shí)了POD和PPO是誘導(dǎo)根原基產(chǎn)生的關(guān)鍵性酶，可以作為鑒定根形態(tài)發(fā)生與否及生根難易的重要的生理指標(biāo)［7，11］。

從可溶性蛋白的含量變化過氧化物酶同工酶具有調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素IAA合成的功能［9］。在蘋果、獼猴桃等植物上的研究已表明，不定芽分化和根的發(fā)生與過氧化物酶（POD）活性及過氧化物酶同工酶的變化密切相關(guān)［4，10］。在本試驗(yàn)也證實(shí)了過氧化物酶同工酶在類原球莖分化芽和根的過程中存在明顯的變化。表明有可能通過在培養(yǎng)基中有針對(duì)性地添加該類酶的促進(jìn)或抑制劑來調(diào)控類原球莖的生長(zhǎng)或分化，使石斛蘭的試管繁殖的各個(gè)環(huán)節(jié)有序地展開。

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