太白楤木抗肝損傷作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究

郭東艷 覃鴻恩 李瑾 呂楊 師延瓊

太白楤木抗肝損傷作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的初步研究

郭東艷 覃鴻恩 李瑾 呂楊 師延瓊

目的初步確定太白楤木抗肝損傷作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法采用經(jīng)典的系統(tǒng)溶劑法(極性由小到大:石油醚－氯仿－乙酸乙酯－正丁醇)依次對太白楤木提取液進(jìn)行萃取，將各提取液分別灌胃給予四氯化碳(CCl4)致急性肝損傷模型小鼠，檢測血清及肝組織中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)、谷胱苷肽過氧化物酶(GSH－Px)的水平，比較各部位的抗肝損傷作用;將篩選出的活性部位用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，不同濃度乙醇進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液分別灌胃給予肝損傷模型小鼠，檢測血清及肝組織中ALT、AST、SOD的活性和MDA、GSH－Px的水平，比較各洗脫部位的抗肝損傷作用。結(jié)果與模型對照組比較，正丁醇部位可明顯降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝組織中SOD的活性和GSH－Px的水平;70%乙醇洗脫的正丁醇提取物可明顯降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝組織中SOD的活性和GSH－Px的水平，且洗脫液劑量與保肝作用有明顯的正相關(guān)性。結(jié)論太白楤木保肝作用的藥效活性物質(zhì)大多存在于70%乙醇洗脫的正丁醇部位，其抗肝損傷作用的活性成分可能與該部位主要成分皂苷類有關(guān)。

太白楤木抗肝損傷有效部位

太白楤木(Aralia taibaiensis)又名飛天蜈蚣七，系五加科楤木屬多年生植物，分布于我國的西部地區(qū)，有著非常豐富的野生資源［1］。主要以根皮入藥，用于各種肝炎、肝硬化腹腔積液、消渴、跌打損傷及風(fēng)濕痹痛等證［2］。近年來的藥理實驗研究表明太白楤木具有確切的保肝作用［3，4］。本實驗采用四氯化碳致小鼠急性肝損傷模型，對太白楤木不同極性部位提取物進(jìn)行保肝作用的藥效學(xué)研究，并結(jié)合大孔樹脂分離技術(shù)篩選太白楤木保肝有效部位，為進(jìn)一步深入研究太白楤木保肝的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)［5］。

材料與方法

1．材料與儀器:(1)動物:5～6周齡潔凈級昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2g，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2007－001。(2)藥物:太白楤木藥材購于陜西眉縣藥材公司，經(jīng)本院王繼濤高級實驗師鑒定為五加科植物楤木屬(Aralialinn)太白楤木(Aralia taibaiensis)的根皮。聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江醫(yī)藥有限公司新昌制藥廠，批號:20100519);ALT、AST試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司;MDA、SOD、GSH－Px試劑盒購自南京建成生物工程研究所。所用試劑均為分析純。(3)儀器:XYJ－2式臺式高速離心機(jī)(江蘇恒豐儀器廠生產(chǎn));UV1102紫外分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn));XD811半自動生化分析儀(上海醫(yī)療儀器公司生產(chǎn));JJQ－P2016J生物組織切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司生產(chǎn))。

2．方法:(1)系統(tǒng)溶劑法提取部位:稱取太白楤木藥材1kg，8倍量80%乙醇回流提取2次，每次2h，回收乙醇，藥渣加8倍量水煎煮兩次，每次2h。合并醇提液和水提液，濃縮至約1000ml。采用系統(tǒng)溶劑法，按溶劑極性從小到大依次萃取，得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和萃取后剩余水相。各部位提取物加適量0．5%CMCNa蒸餾水溶液研磨配置成混懸液(每毫升相當(dāng)于原藥材0.3g)，備用。(2)大孔吸附樹脂提取分離部位:取一定量正丁醇部位加水適量稀釋，加于已處理好的HPD100型大孔樹脂柱上，控制吸附流速為1BV/h，然后用4BV的去離子水除雜，再分別用2BV的30%、70%、90%乙醇以1BV/h的流度洗脫，收集洗脫液，回收乙醇后繼續(xù)減壓濃縮成稠膏，60℃烘箱干燥，分別稱重，即得楤木提取物［6，7］。再將上述不同濃度洗脫物配制成高中低濃度溶液(每毫升分別相當(dāng)于原藥材1、0．5、 0.25g)，備用。(3)抗肝損傷作用實驗研究［8，9］:1)系統(tǒng)溶劑法提取各部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠肝功能的影響:取潔凈級昆明種小鼠96只，雌雄各半，體重20±2g，按體重隨機(jī)分為8組，每組12只，雌雄分開飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，聯(lián)苯雙酯組按0．6g/kg給藥，正常對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，其余各組均按0．4毫升/(天·只)劑量進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)灌胃7天。末次給藥后2h，將CCl4溶于精制花生油中，配成0．1%的CCl4花生油溶液，按0．1ml/10g進(jìn)行腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，禁食不禁水，16h后摘眼球取血，3500r/min離心10min，上清液保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r立即剖取肝臟，取0．5g肝組織，剪碎，放于玻璃勻漿器中，加預(yù)冷的9倍體積的0．9%生理鹽水，2500r/min離心10min，上清液保存?zhèn)溆茫?］。血清生化指標(biāo)ALT、AST的測定均按試劑盒說明書具體步驟進(jìn)行，用半自動生化分析儀進(jìn)行測定。肝組織生化指標(biāo)SOD、GSH－Px、MDA的測定均按試劑盒說明書具體步驟進(jìn)行，用紫外分光光度計進(jìn)行測定。2)大孔吸附樹脂分離部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠的影響:取潔凈級昆明種小鼠96只，雌雄各半，體重20±2g，按體重隨機(jī)分為8組，每組12只，雌雄分開飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)5天，聯(lián)苯雙酯組按0．6g/kg給藥［6］，正常對照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，其余各組均按0．4毫升/(天·只)劑量進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)灌胃7天。處理方法用系統(tǒng)溶劑法。

結(jié)果

1．系統(tǒng)溶劑法提取各部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠肝功能的影響:用半自動生化分析儀進(jìn)行測定血清生化指標(biāo)ALT、AST，紫外分光光度計測定肝組織生化指標(biāo)SOD、GSH－Px、MDA。結(jié)果見表1、表2。實驗結(jié)果表明，模型組的各指標(biāo)水平相對空白對照組均有顯著性差異(P＜0．01)。正丁醇提取物組能明顯降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝組織中SOD的活性和GSH－Px的水平，具有顯著性差異(P＜0．01);氯仿組能降低ALT、AST和MDA水平、增加GSH－Px的水平。石油醚、乙酸乙酯及萃取后剩余的水相則作用不明顯。

2．大孔吸附樹脂分離部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠的影響:用半自動生化分析儀進(jìn)行測定血清生化指標(biāo)ALT、AST，紫外分光光度計測定肝組織生化指標(biāo)SOD、GSH－Px、MDA。結(jié)果見表3、表4。

表1 各提取部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響±s，n=12，U/L)

表1 各提取部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響±s，n=12，U/L)

與對照組比，*P＜0．01;與模型組相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

ALTAST空白對照組組別493．25±24．52368．75±40．65 38．83±4．4976．58±11．39 CCl4模型組515．25±37．11*385．92±30．56*聯(lián)苯雙酯組285．25±27．45△△253．50±54．27△△石油醚組492．75±30．85370．17±23．09氯仿組480．58±33．24△359．67±24．83△乙酸乙酯組483．58±37．79366．83±25．34正丁醇組359．17±37．84△△307．33±38．87△△剩余水相組

表2 各提取部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH－Px、MDA的影響±s，n=12)

表2 各提取部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH－Px、MDA的影響±s，n=12)

與對照組比，*P＜0．01;與模型組相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

組別MDA(nmol/g)GSH－Px(U/mg)SOD(U/mg) 52．05±12．43182．48±46．38200．45±21．36 CCl4模型組265．41±29．76*77．58±17．17*78．84±26．51＊＊聯(lián)苯雙酯組121．92±19．19△△119．02±25．51△△158．94±28．97△△石油醚組260．85±29．9587．80±23．8990．54±37．03氯仿組233．56±29．48△97．93±18．76△107．44±38．72乙酸乙酯組249．15±29．0390．69±20．32100．77±35．57正丁醇組129．01±20．21△△106．53±17．72△△141．43±44．07△△剩余水相組空白對照組237．24±43．2592．33±21．4894．22±25．17

討論

肝臟是人體內(nèi)最大的實質(zhì)器官，結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，易受多種病原體、毒物及免疫病理累及。四氯化碳進(jìn)入肝細(xì)胞后，使線粒體膜的脂質(zhì)溶解，從而影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，使酶蛋白質(zhì)合成減少，造成酶的破壞，因而影響代謝功能和能量的生成，致使肝細(xì)胞的變性、壞死。本實驗通過采用經(jīng)典的系統(tǒng)溶劑法并結(jié)合大孔樹脂分離技術(shù)，對太白楤木抗肝損傷作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明:正丁醇部位可顯著降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝組織中SOD的活性和GSH－Px的水平，氯仿、石油醚等部位作用不明顯。因此初步分析:正丁醇部位所含成分可能為太白楤木抗肝損傷作用的主要活性成分。對正丁醇部位進(jìn)一步進(jìn)行大孔樹脂分離，分別得到不同醇濃度洗脫部位，結(jié)果表明70%乙醇洗脫部位大中小劑量組均能顯著降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝組織中SOD的活性和GSH－Px的水平，且劑量與保肝作用有明顯的正相關(guān)，結(jié)合太白楤木中的主要化學(xué)成分為皂苷類，因此初步判斷太白楤木中皂苷含量的高低與抗肝損傷作用可能有一定的相關(guān)性，其活性成分的確定及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步試驗。

表3 不同濃度的各洗脫部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響±s，n=12，U/L)

表3 不同濃度的各洗脫部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響±s，n=12，U/L)

與對照組比，*P＜0．01;與模型組相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

38．75±4．1373．83±9．03模型組292．58±45．01*310．50±38．40*陽性組114．83±19．30△△186．58±29．84△△30%乙醇高劑量252．25±28．54△275．42±21．21△30%乙醇中劑量258．92±37．64282．50±24．01 30%乙醇低劑量273．25±31．92286．42±21．56 70%乙醇高劑量138．75±21．46△△147．50±26．95△△70%乙醇中劑量187．92±26．70△△200．42±38．92△△70%乙醇低劑量205．83±25．52△△233．67±29．39△△90%乙醇高劑量277．50±22．63286．58±18．85 90%乙醇中劑量280．08±22．05293．17±23．23 90%乙醇低劑量ALTAST空白組組別281．92±28．10300．67±23．05

實驗結(jié)果表明:模型組的各指標(biāo)水平相對空白對照組均有顯著性差異(P＜0．01)。70%乙醇洗脫液各劑量均能明顯降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝組織中SOD的活性和GSH－Px的水平，具有顯著性差異(P＜0．01)，;30%乙醇洗脫部位的高劑量組能降低CCl4引起的ALT、AST升高，增加肝組織中SOD的活性及GSH－Px的水平(P＜0．05)，90%乙醇洗脫部位作用不明顯。

表4 不同濃度的各洗脫部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH－Px、MDA的影響±s，n=12)

表4 不同濃度的各洗脫部位對CCl4引起的急性肝損傷小鼠肝組織SOD、GSH－Px、MDA的影響±s，n=12)

與對照組比，*P＜0．01;與模型組相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

組別MDA(nmol/g)GSH－Px(U/mg)SOD(U/g) 37．92±7．91186．90±35．12177．37±27．33模型組128．66±26．84*93．51±36．17*82．12±33．20*陽性組50．44±11．62△△159．84±23．99△△142．95±17．92△△30%乙醇高劑量109．49±15．15123．72±26．42△114．74±28．89△30%乙醇中劑量110．53±17．88117．09±11．69111．63±39．72 30%乙醇低劑量112．05±22．25109．80±12．13103．37±44．28 70%乙醇高劑量71．70±8．81△△151．86±25．20△△137．44±27．70△△70%乙醇中劑量77．49±6．61△△137．62±21．01△△127．89±12．87△△70%乙醇低劑量84．23±11．31△△128．75±14．71△△119．42±19．11△△90%乙醇高劑量110．57±23．46110．37±23．8494．32±20．46 90%乙醇中劑量111．25±20．89108．28±15．3691．80±21．67 90%乙醇低劑量空白組115．86±15．96102．67±16．3792．63±30．67

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(收稿:2012－02－10)

(修回:2012－02－27)

Preliminary Study on Pharmacodynamic Material Basis of Aralia Taibaiensis in Anti－h(huán)epatic Injury．

Guo Dongyan，Qin Hongen，Li Jin，Lv Yang，Shi Yanqiong．The Medicine College of Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi 712046，China

ObjectiveTo study the pharmacodynamic material basis of Aralia taibaiensis in anti－h(huán)epatic injury．MethodsThe experimental drugs were systematically extracted by solutions method(petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，N－buoh)from Aralia taibaiensis according to solutions'polarity．The mice model of acute liver injury was established by carbon tetrachloride．Activities of ALT，AST，SOD were examined，and levels of MDA，GSH－Px were determined．The hepatic histological changes were observed by optical microscope．The effect of anti－h(huán)epatic injury was compared．The effective part was in macroporous adsorption resin to purification，with different concentration gradient itself on ethanol．Then the Same procedures were as above．And the effect of anti－h(huán)epatic injury was compared in each elution part．ResultsCompared with model control group，N－buoh extract of Aralia taibaiensis could significantly de-crease the ALT，AST，MDA activities by carbon tetrachloride，improve SOD activity and GSH－Px level．Pathological results showed that N－buoh extract of Aralia taibaiensis could significantly reduce the liver injury induced by carbon tetrachloride．The elution things by 70%ethanol from N－buoh extract could significantly decrease the ALT，AST，MDA activities by carbon tetrachloride，improve SOD activity and GSH－Px level．Dosages of eluent were positively related to anti－h(huán)epatic injury．ConclusionThe effective parts for anti－h(huán)epatic injury exist mostly at the part of 70%ethanol from N－buoh extract．The active ingredients of anti－h(huán)epatic injury might be combined with it's saponins ingredients．

Aralia taibaiensis;Anti－h(huán)epatic injury;Effective composition

陜西省教育廳資助項目(09JS015，2010JK506);陜西省中管局資助項目(ZY30，ZY31)

712046西安，陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院