超聲波輔助提取扁核木葉蛋白的工藝優(yōu)化

梁麗琴 魏學(xué)智 段江燕 張曉俊 安 娜

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨汾 041004)

蛋白質(zhì)是供給必需的氨基酸以維持生理健康的重要物質(zhì)，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展及生活水平的提高，全球蛋白質(zhì)資源緊缺現(xiàn)象日益嚴(yán)重。動物蛋白生產(chǎn)成本較高，且含有膽固醇，不適于高血壓及心臟病等病人。植物蛋白營養(yǎng)豐富，必需氨基酸組成與比例均優(yōu)于動物蛋白，尤其是它不含膽固醇，因而深受食品科學(xué)家的青睞。近年來，農(nóng)產(chǎn)品價格不斷上漲，其中豆類產(chǎn)品價格的上漲使得種子蛋白的生產(chǎn)加工成本也逐漸提高。而植物葉蛋白資源豐富，其必需氨基酸的數(shù)量和比例均優(yōu)于大豆餅蛋白［1］，因而開發(fā)植物葉蛋白具有重要意義。

扁核木(Prinsepia uniflora Batal)為薔薇科扁核木屬的落葉灌木，在山西、陜西、內(nèi)蒙古、東北等地均有分布。扁核木枝繁葉茂，果實(shí)可以食用，種子可以榨油也可以入藥，因而在生產(chǎn)、生態(tài)和造景觀賞方面均有很好的開發(fā)應(yīng)用前景［2］。目前，有關(guān)扁核木的開發(fā)研究主要集中在育種栽培方面，而關(guān)于扁核木的果實(shí)及葉的開發(fā)研究未見報道。因而，本試驗將對扁核木葉蛋白的提取方法進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的酸加熱法提取葉蛋白效率低，純度低，且耗時。酶法雖然可以提高效率，但酶價格昂貴，易失活，提取過程也較難控制。超聲波能夠產(chǎn)生增溶作用［3］，提取效率高，提取時間短，且其成本低、設(shè)備簡單、操作容易，現(xiàn)已被用于大豆蛋白［4－6］、玉米醇溶蛋白［7］、蕎麥蛋白［8］、棉籽蛋白［9］、小麥胚芽蛋白［10］及花生蛋白［11］等的輔助提取，因此，本試驗將探討超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白，以期為扁核木葉蛋白的食品開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

扁核木葉:采自山西臨汾龍寺鎮(zhèn);所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS－3C酸度計、HJ－6A數(shù)顯多頭磁力恒溫攪拌器:金壇市榮華儀器制造有限公司;HAP－300超聲波處理儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;LG－24A型高速離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;LG10－2.4A型高速冷凍離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國華電器有限公司;UV－7504c紫外可見分光光度計:上海欣茂儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 扁核木葉的處理

取新鮮的無病蟲害扁核木葉，放于潔凈的培養(yǎng)皿中，用自來水沖洗3次后，再用蒸餾水洗3次，用濾紙吸去多余水分。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10 g扁核木葉，將其剪成0.5 cm長的小段，加石英砂充分研磨后，加入50 mL pH 3.6的磷酸鹽緩沖液中，攪拌均勻后于40℃下超聲波提取30 min，然后在4 000 r/min離心20 min，取上清液并測定體積，取部分上清液進(jìn)行半微量凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量，剩余上清液用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm波長下測定提取液的吸光度Y［12］。以提取液蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)X，吸光度Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最小二乘法擬合得方程:

1.3.3 扁核木葉蛋白的酸加熱提取及超聲波輔助提取方法

準(zhǔn)確稱取2 g新鮮的扁核木葉，將其剪成0.5 cm長的小段，加石英砂充分研磨，按一定液料比加入一定溫度下預(yù)熱的pH磷酸鹽緩沖液，在一定溫度下攪拌一定時間(超聲波處理，功率為50 W)，4 000 r/min離心15 min，再將離心液用快速濾紙過濾除去漂浮物，定容至30 mL，用考馬斯亮藍(lán)法595 nm波長下測定濾液的吸光值，并計算扁核木葉蛋白含量［13］。

1.3.4 扁核木葉蛋白提取率計算［8］

1.3.5 扁核木葉基本化學(xué)成分測定［14］

蛋白質(zhì)含量測定:凱氏定氮法測定。粗脂肪含量測定:索氏抽提法。水分測定:常壓烘干法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對單因素試驗結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，正交試驗結(jié)果采用極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁核木葉基本化學(xué)成分

由表1可知，扁核木葉蛋白占葉片鮮重的5.36%。據(jù)資料報道［15］，葉蛋白主要包括溶解性好的細(xì)胞質(zhì)蛋白和葉綠體內(nèi)基質(zhì)蛋白、線粒體蛋白、難溶的葉綠體結(jié)構(gòu)蛋白、線粒體結(jié)構(gòu)蛋白、核蛋白及細(xì)胞壁蛋白、另外還有脫氫酶過氧化物酶及多酚氧化酶等多種酶組成的蛋白質(zhì)混合體。其中，核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶占細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的70%～80%。

表1 扁核木葉基本化學(xué)成分/%

2.2 處理時間對扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定液料比1∶10，pH 3.6，溫度40 ℃為不變因素，處理時間分別為 10、20、30、40、50 min，時間對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖1。

由圖1可知，處理時間在10～50 min之內(nèi)，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白，其提取率均遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的酸溶法。在處理時間為10～20 min之間，用超聲波輔助法提取時，隨著時間的延長，扁核木葉蛋白的提取率與時間呈正相關(guān)，超過20 min后，提取率增加不再明顯，且逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是由于在10～20 min之內(nèi)，隨著時間的延長，形成的氣泡逐漸增多，高頻振蕩逐漸劇烈，吸收的聲能逐漸增大，破壁的效果逐漸增強(qiáng)，蛋白質(zhì)溶出也逐漸增多。而超過20 min后，隨著時間的延長，提取率反而不斷下降，這可能是由于超聲波的強(qiáng)烈振動及熱效應(yīng)作用導(dǎo)致蛋白變性，從而使葉蛋白水溶性變差。

圖1 處理時間對扁核木葉蛋白提取率的影響

2.3 溫度對扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定液料比1∶10，pH 3.6，處理時間30 min 為不變因素，溫度分別為30、35、40、45、50 ℃，溫度對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖2。

圖2 溫度對扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖2可知，在30～45℃之間，隨著溫度的升高，扁核木葉蛋白的提取率也逐漸增加，當(dāng)溫度為45℃時，無論是傳統(tǒng)的酸加熱法還是加以超聲波輔助，葉蛋白的提取率均最高，此時，用超聲波輔助酸溶法提取葉蛋白的提取率可達(dá)85.72%。當(dāng)溫度超過45℃時，葉蛋白提取率開始下降，這可能是由于此時蛋白質(zhì)開始變性，蛋白質(zhì)分子展開導(dǎo)致疏水基團(tuán)的暴露及蛋白質(zhì)分子相互纏繞，從而使溶解度降低。整體看來，不同溫度下，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率也均高于傳統(tǒng)的酸加熱法的提取率。

2.4 液料比對扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定pH 3.6，溫度40℃，處理時間30 min為不變因素，液料比分別為 6、8、10、12、14，液料比對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖3。

圖3 液料比對扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖3可知，在液料比為6～14之間時，隨著液料比的增加，提取率逐漸增高，當(dāng)液料比為12時，扁核木葉蛋白的提取率達(dá)到最高，當(dāng)液料比超過12時，葉蛋白的提取率趨于穩(wěn)定，說明此時蛋白質(zhì)已被最大程度的溶解出來。整體看來，在不同液料比下，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率也均遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的酸加熱法的提取率。

2.5 pH對扁核木葉蛋白提取率的影響

設(shè)定液料比1∶10，溫度40℃，處理時間30 min為不變因素，pH 分別為 3.0、3.6、4.2、4.8、5.4，pH對扁核木葉蛋白提取率的影響如圖4。

圖4 pH對扁核木葉蛋白提取率的影響

由圖4可知，在pH 3.0～5.4之間，扁核木葉蛋白的提取率與pH呈負(fù)相關(guān)，在pH為3.0時扁核木葉蛋白提取率最高。當(dāng)提取液pH逐漸增大時，扁核木葉蛋白的提取率也逐漸下降。這是由于蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液pH小于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時，酸性溶液中大量的氫離子使蛋白質(zhì)氫離子化而帶有大量正電荷，這些帶有正電荷的基團(tuán)會與周圍溶液中的水分子發(fā)生結(jié)合，在蛋白質(zhì)周圍形成一層水化層，從而使得蛋白質(zhì)更穩(wěn)定的存在于溶液中，即增加了蛋白質(zhì)的溶解度。在pH 3.0～5.4酸性范圍內(nèi)，扁核木葉中的蛋白質(zhì)帶有正電荷，且隨著pH的逐漸增大，葉蛋白質(zhì)所帶正電荷逐漸減少，蛋白質(zhì)的溶解度也逐漸降低。整體看來，在pH 3.0～5.4之間，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白的提取率也均遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的酸加熱法的提取率。

2.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以節(jié)約生產(chǎn)成本為原則，對溫度、時間、pH、液料比4個因素各取3個水平進(jìn)行正交試驗，以扁核木葉蛋白的提取率為指標(biāo)，探索酸加熱法及超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳提取條件。正交試驗因素－水平設(shè)計見表2，正交試驗結(jié)果與極差分析見表3。

通過表3極差分析結(jié)果可知，酸溶法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝為A3B3C1D2，即時間25 min、溫度45℃、液料比8、pH 3.6，各因素對扁核木葉蛋白提取率影響的顯著次序為A＞C＞D＞B，即時間＞液料比＞pH＞溫度;超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝為B＞C＞D＞A，即時間20 min、溫度40℃、液料比12、pH4.2，各因素對扁核木葉蛋白提取率影響大小的次序為B＞C＞D＞A，即:溫度＞液料比＞pH＞時間。

2.7 驗證試驗

利用上述最佳工藝條件分別進(jìn)行驗證試驗，實(shí)測得用酸加熱法提取扁核木葉蛋白，其提取率為70.37%，用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白，其提取率為87.90%，超聲波輔助酸加熱法較傳統(tǒng)的酸加熱法提取扁核木葉蛋白的提取率提高了17.53%。

2.8 酸沉淀扁核木葉蛋白

用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)扁核木葉蛋白超聲波提取液至 pH 5.4，4 000 r/min 離心 15 min，脂肪、葉綠素、糖類及有機(jī)物等雜質(zhì)留于上清液中，去上清液，沉淀則為純化的扁核木葉蛋白。

表3 正交試驗結(jié)果與極差分析

3 結(jié)論

3.1 采用酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝條件:時間 25 min、溫度 45 ℃、液料比 8、pH 3.6，此時，扁核木葉蛋白的提取率為70.37%。

3.2 采用超聲波輔助酸加熱法提取扁核木葉蛋白的最佳工藝條件:時間20 min、溫度40℃、液料比12、pH 4.2，此時，扁核木葉蛋白的提取率為87.9%。

3.3 相對于傳統(tǒng)的酸溶法，用超聲波輔助酸溶法提取扁核木葉蛋白，節(jié)省了時間，降低了溫度，并增大了pH，這大大降低了生產(chǎn)成本。

3.4 采用超聲波輔助酸溶法提取可以提高扁核木葉蛋白的提取率，與單純酸溶法提取法相比，扁核木葉蛋白提取率提高了17.53%。

3.5 將扁核木葉蛋白超聲波提取液調(diào)至pH 5.4，對扁核木葉蛋白進(jìn)行酸沉淀，可將扁核木葉蛋白從提取液中分離出來。

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