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    1-苯基-2-硫脲對斑馬魚胚胎發(fā)育與黑色素生成的影響

    2012-09-17 13:28:58張利軍史慧勤苑曉燕余壽忠彭雙清
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2012年9期
    關(guān)鍵詞:孵化率斑馬魚黑色素

    張利軍,史慧勤,苑曉燕,余壽忠,趙 君,彭雙清

    (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心,北京 100071)

    1-苯基-2-硫脲對斑馬魚胚胎發(fā)育與黑色素生成的影響

    張利軍,史慧勤,苑曉燕,余壽忠,趙 君,彭雙清

    (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心,北京 100071)

    目的 1-苯基-2-硫脲(PTU)可抑制斑馬魚胚胎黑色素的產(chǎn)生,保持斑馬魚透明,便于形態(tài)觀察和信號檢測。本文研究了PTU對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響和抑制斑馬魚胚胎黑色素生成,保持斑馬魚透明性的最佳濃度。方法 用不同濃度PTU處理23 hpf(受精后,hours post fertilization,hpf)斑馬魚胚胎,作用57 h后觀察80 hpf斑馬魚的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)改變,計算死亡率和孵化率,測量心率和靜脈竇-動脈球之間的距離。結(jié)果 濃度為0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU可以有效抑制黑色素生成,保持斑馬魚整體透明,對斑馬魚心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和生理功能無影響,且不影響斑馬魚正常孵化過程。隨著PTU濃度的增加,斑馬魚死亡率增加,孵化率下降,出現(xiàn)心包水腫,心臟畸形等改變,心率下降,靜脈竇-動脈球之間的距離增大。結(jié)論 濃度不高于0.296mmol/L的PTU溶液能有效抑制斑馬魚黑色素生成,對斑馬魚心血管毒性研究無影響。

    1-苯基-2-硫脲;斑馬魚;心率;孵化率

    斑馬魚(Danio rerio)作為一種新型脊椎模式生物已被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)研究。斑馬魚易飼養(yǎng),繁殖能力強,斑馬魚胚胎透明,生長發(fā)育快,施藥方式簡單[1]。斑馬魚胚胎在發(fā)育早期,即使心血管系統(tǒng)有缺陷,也可以依靠溶解氧繼續(xù)發(fā)育。目前,斑馬魚已成為OECD和ISO毒性試驗的推薦測試物種[2-4]。斑馬魚胚胎透明,發(fā)育到24 h左右則開始出現(xiàn)黑色素,黑色素細(xì)胞會影響基因表達(dá)信號、綠色熒光蛋白信號、整體原位雜交信號檢測。因此,需要對斑馬魚胚胎進行處理,抑制黑色素生成,保持其透明性。研究表明在斑馬魚原腸胚期(5.5 hpf)后使用PTU溶液代替養(yǎng)魚用水,能有效抑制黑色素生成,保持斑馬魚透明性,但PTU也具有毒性作用,高濃度PTU可影響斑馬魚孵化率,甚至產(chǎn)生致畸和致死效應(yīng)[5]。本文研究不同濃度 PTU對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響,為運用斑馬魚進行心血管毒性評價研究時選擇合適濃度PTU提供參考資料。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    實驗所用斑馬魚為AB系斑馬魚,由北京大學(xué)生命科學(xué)院惠贈,本實驗室繁殖。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照標(biāo)準(zhǔn)的方法[6]。雌雄斑馬魚成魚分開飼養(yǎng)于愛生斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中。水溫保持在28.5±1℃,鹽度為 450~500 mS/cm2,pH 為 7.5~8.5,光照周期為照明14 h/黑暗10 h交替進行,每日喂2次活豐年蝦。采卵時,首日傍晚按雌雄1∶1的比例將健康斑馬魚成魚放入交配缸內(nèi),次日清晨獲得受精卵。對受精卵進行清洗后,移入斑馬魚胚胎培養(yǎng)用水(60 mg/mL海鹽)中,28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2 受試藥物

    1-苯基-2-硫脲(PTU)購自 sigma公司。將 PTU粉末溶于 0.3× Danieau(17mmol/L NaCl,2mmol/L KCl,0.12mmol/L MgSO4,1.8mmol/L Ca(NO3)2,1.5mmol/L HEPS,pH7.6)培養(yǎng)液中,配制成0.197mmol/L、0.296 mmol/L、0.742 mmol/L、1.48mmol/L、2.96mmol/L、7.39mmol/L 濃度的 PTU 試驗液。

    1.3 處理胚胎方法

    在Olympus SZX10型體視顯微鏡下選擇發(fā)育至23 hpf(28體節(jié)期)的野生型AB系斑馬魚胚胎,按照隨機分配原則,每濃度30枚胚胎,加入相應(yīng)濃度PTU。對照組為胚胎培養(yǎng)用水。隨后加蓋封閉,置于28.5℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi),讓胚胎繼續(xù)發(fā)育。待斑馬魚發(fā)育至80 hpf進行觀察、拍照。此刻,未暴露斑馬魚胚胎已都孵化成幼魚[7]。試驗過程中,每24 h更換1次PTU溶液。

    1.4 死亡率與孵化率計算

    每天觀察1次斑馬魚胚胎死亡、存活情況,并詳細(xì)記錄,將死亡胚胎和幼魚移去。斑馬魚發(fā)育至80 hpf,計算累積死亡率百分率,可根據(jù)艾博特(Abbott's)公式用對照組的死亡率進行校正[8]:

    P=100- [(C-P')/C×100]

    P——已校正的存活百分率,%;

    P'——試驗濃度組中所觀察到的存活百分率,%;

    C——對照組中的存活百分率,%。

    斑馬魚胚胎從48 h開始孵化,胚胎軀體全部(從頭到尾)從絨毛膜內(nèi)出來,認(rèn)為斑馬魚由胚胎孵化為幼魚。斑馬魚發(fā)育到80 hpf,基本全部孵化[9]。因此,我們從48 hpf定時觀察孵化情況,80 hpf統(tǒng)計各組斑馬魚孵化率。

    1.5 形態(tài)觀察

    Olympus SZX10型體視顯微鏡下每日觀察PTU對斑馬魚的影響,觀察的毒性終點包括:心包和卵黃囊水腫、出血、畸形等。

    1.6 心率測量

    斑馬魚發(fā)育至80 hpf,從各處理組和對照組隨機選擇5條斑馬魚,在用顯微攝像系統(tǒng)(340M-00-GE,DVC Co.,USA)對斑馬魚心跳攝像 30 s。使用Image J軟件對斑馬魚心跳錄像進行分析,統(tǒng)計心率[10]。

    1.7 靜脈竇(sinus venous)與動脈球(bulbus arteriosus)距離測量

    斑馬魚心臟發(fā)育基本在最初2 d完成。30 hpf形成心室和心房,36 hpf心臟發(fā)生向右環(huán)化[11],使得心房、心室在側(cè)面觀上部分重疊,心室在心房的右前側(cè)。心臟發(fā)育過程受到影響,心房和心室的位置將發(fā)生改變,靜脈竇(血液進入斑馬魚心臟的部位)和動脈球(血液流出斑馬魚心臟的部位)之間的距離相應(yīng)發(fā)生改變,兩者之間的距離是評價心臟環(huán)化程度的指標(biāo),通過測量靜脈竇與動脈球之間的距離可量化評價藥物對斑馬魚心臟影響程度[12]。

    1.8 統(tǒng)計分析

    2 結(jié)果

    2.1 PTU對斑馬魚死亡率的影響

    斑馬魚發(fā)育至80 hpf,統(tǒng)計胚胎和幼魚死亡數(shù),結(jié)果如表1所示,對照組斑馬魚發(fā)育正常,無胚胎和幼魚死亡,死亡率為0。2.96mmol/L PTU實驗組斑馬魚出現(xiàn)死亡,死亡率為40.0±8.82%。7.39mmol/L PTU實驗組斑馬魚全部死亡,死亡率達(dá)到100%。

    表1 PTU對斑馬魚胚胎死亡率的影響Tab.1 Mortality of PTU on zebrafish embryos

    2.2 PTU對斑馬魚孵化率的影響

    結(jié)果如表2所示,斑馬魚發(fā)育至80 hpf,對照組斑馬魚胚胎已全部孵化成幼魚。PTU可抑制斑馬魚孵化,隨著PTU濃度的增加,孵化率逐漸下降,0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU組斑馬魚胚胎全部孵化,0.742mmol/L組孵化率為 17.78±5.09%,1.48mmol/L PTU組斑馬魚胚胎孵化率為8.89±1.92%。2.96mmol/L PTU組斑馬魚無孵化,孵化率為0。

    表2 PTU對斑馬魚孵化率的影響Tab.2 Hatching rates of PTU on zebrafish embryos

    2.3 PTU對斑馬魚形態(tài)影響

    結(jié)果如圖1所示,斑馬魚胚胎發(fā)育至80 hpf,對照組斑馬魚胚胎孵化成幼魚,形態(tài)正常,心血管系統(tǒng)等無畸形,有黑色素沉著。PTU實驗組斑馬魚透明,無黑色素。0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU實驗組斑馬魚胚胎孵化成幼魚,形態(tài)正常,心血管系統(tǒng)等無形態(tài)學(xué)改變,無黑色素沉著。0.742mmol/L PTU實驗組的斑馬魚胚胎孵化延遲,1.48mmol/L、2.96mmol/L PTU實驗組斑馬魚出現(xiàn)心包水腫,心臟畸形等形態(tài)學(xué)改變,畸形程度隨著濃度的增加而嚴(yán)重。7.39mmol/L PTU實驗組斑馬魚胚胎無孵化,全部死亡。

    圖1 不同濃度PTU處理后,80 hpf斑馬魚發(fā)育情況Fig.1 Normal and abnormal development of zebrafish embryos to PTU for different exposure concentration at 80hpf

    2.4 PTU對斑馬魚心率影響

    PTU作用57 h后,測量80 hpf斑馬魚心率。結(jié)果如圖2所示,PTU實驗組斑馬魚心率下降。與對照組相比較,0.197mmol/L,0.296mmol/L PTU實驗組斑馬魚心率和對照組斑馬魚心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。0.742mmol/L,1.48mmol/L,2.96mmol/L PTU 實驗組斑馬魚心率與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,隨著PTU濃度增加而逐漸降低,呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。而7.39mmol/L PTU實驗組斑馬魚全部死亡,無心率數(shù)據(jù)。

    圖2 PTU對80hpf斑馬魚心率的影響Fig.2 PTU effects on heart rate of zebrafish embryos at 80hpf

    2.5 PTU對斑馬魚SV-BA距離的影響

    PTU可影響斑馬魚心臟發(fā)育,造成斑馬魚心臟環(huán)化不全,SV-BA之間的距離發(fā)生改變。結(jié)果如圖3所示,1.48mmol/L、2.96mmol/LPTU處理組斑馬魚SV-BA距離比對照組斑馬魚SV-BA間距增大,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    圖3 80 hpf斑馬魚靜脈竇(SV)與動脈球(BA)之間的距離Fig.3 Distance between the sinus venosus(SV)and bulbus arterious(BA)in 80hpf zebrafish embryos

    3 討論

    斑馬魚在發(fā)育初期通體透明,發(fā)育過程中逐漸出現(xiàn)色素。斑馬魚有3種色素細(xì)胞:黑色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹色素細(xì)胞[13]。斑馬魚發(fā)育至 24 hpf,黑色素開始從視網(wǎng)膜上皮生成,幾小時內(nèi)黑色素細(xì)胞迅速布滿胚胎。黑色素細(xì)胞的形成會對實驗數(shù)據(jù)的采集和結(jié)果的判斷產(chǎn)生干擾。為排除黑色素的影響,保證科學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性,需要保持斑馬魚胚胎透明。目前,最常用的方法是在試驗過程中,加入PTU抑制黑色素的生成。PTU的作用原理是降低酪氨酸羥化酶活性,抑制酪氨酸向黑色素的轉(zhuǎn)換,從而阻斷黑色素合成途徑[14]。本研究結(jié)果表明,從23 hpf(28體節(jié)期)添加0.197mmol/L~0.296mmol/L PTU能有效抑制發(fā)育至80 hpf斑馬魚黑色素形成,保持斑馬魚透明性。

    對于毒理學(xué)試驗而言,毒性終點的選擇至關(guān)重要。生理功能的改變要早于形態(tài)學(xué)的改變,是最合適和最敏感的評價指標(biāo)[15]。研究發(fā)現(xiàn)心率是評價心臟功能最靈敏的指標(biāo)。斑馬魚心臟在22 hpf開始跳動,起初是一種蠕動波。36 hpf心房和心室協(xié)調(diào)收縮。48 hpf功能性瓣膜開始形成。本研究結(jié)果表明0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU對斑馬魚心率不產(chǎn)生影響。0.742mmol/L、1.48mmol/L、2.96mmol/L PTU影響斑馬魚心臟功能,顯著性減低斑馬魚心率,呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系。

    孵化是斑馬魚生命過程中一個關(guān)鍵點,但不是個體發(fā)育點,不屬于斑馬魚胚胎發(fā)育的一個具體階段。孵化是一個生化和行為相結(jié)合的過程。首先,孵化島合成消化絨毛膜的酶,這些酶是高絨毛膜裂解酶(HCE)和低絨毛膜裂解酶(LCE);然后這些酶裂解絨毛膜,斑馬魚胚胎軀體扭曲撕開絨毛膜,脫去絨毛膜,完成孵化過程,成為幼魚。因此,化合物對這兩環(huán)節(jié)中任一環(huán)節(jié)產(chǎn)生毒性作用都將影響其孵化,降低孵化率和延遲孵化[9]。孵化率是評價化合物對斑馬魚是否產(chǎn)生毒性作用的一個敏感指標(biāo)。我們發(fā)現(xiàn)濃度高于0.742mmol/L的PTU可對斑馬魚胚胎產(chǎn)生毒性作用,降低其孵化率。

    高濃度的PTU不僅影響斑馬魚心臟功能,還影響斑馬魚心臟發(fā)育過程,產(chǎn)生器質(zhì)性損害,引起心包水腫等畸形,心臟環(huán)化不全,表現(xiàn)為SV與BA之間的距離明顯增長。我們研究發(fā)現(xiàn)0.197mmol/L、0.296mmol/L PTU對斑馬魚心臟形態(tài)和功能不產(chǎn)生任何影響,不影響斑馬魚胚胎心臟發(fā)育過程和孵化過程,能很好抑制斑馬魚黑色素生成,保持斑馬魚透明性。Karlsson等[5]報道75mmol/L PTU可抑制黑色素生成,且對斑馬魚胚胎結(jié)構(gòu)和孵化率無影響,但該濃度并未被其他研究人員接受??赡苁窃摑舛戎荒芡耆种?6 h前斑馬魚黑色素生成,并不能完全抑制36 h后斑馬魚黑色素生成[16]。我們從斑馬魚心血管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能兩方面研究PTU的心血管毒性作用,發(fā)現(xiàn)使用的PTU濃度雖然比文獻報道的濃度要高,但對斑馬魚的結(jié)構(gòu)和生理功能沒有影響,且能有效保持發(fā)育至80 hpf斑馬魚胚胎的透明性。所以,我們認(rèn)為在斑馬魚心血管毒性試驗中可以選擇低于0.296mmol/L濃度的PTU抑制斑馬魚黑色素的生成,且對實驗結(jié)果不會產(chǎn)生影響。因此,在保證PTU對斑馬魚心血管系統(tǒng)無毒性影響的前提下,可以選擇合適的PTU濃度,以保證抑制黑色素生成的效果。

    致謝:感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所張靖溥老師提供DVC顯微攝像系統(tǒng)。

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    Developmental and Melanogenesis Effects of 1-phenyl 2-thiourea(PTU)in Zebrafish Embryos

    ZHANG Li-jun,SHI Hui-qin,YUAN Xiao-yan,YU Shou-zhong,ZHAO Jun,PENG Shuang-qing
    (Research and Evaluation Center for Toxicology,Institute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)

    Objective To generate transparent zebrafish,embryos may be treated with 1-phenyl 2-thiourea(PTU)to inhibit melanogenesis during embryogenesis.When working with techniques designed to study gene expression during embryogenesis,especially in teleosts,signal detection may be aggravated by pigmentation.Here we focus on the effects of PTU on embryo,and describes an optimized protocol for generating transparent zebrafish using PTU.Methods zebrafish embryos at the stage of 23 hpf(hours post fertilization)were treated with serial concentrations of PTU.Morphological and physiological endpoints were selected and quantified for unexposed and exposed embryos.Mortality,heart rate,hatching rate and SV-BA distance were detected until 80 hpf.Results Exposure to 0.197mmol/L and 0.296mmol/L PTU completely inhibited pigmentation while avoiding problems with embryo mortality,teratogenesis,reduced hatching frequency,and heart rate.The highest PTU concentration resulted in reduced hatching frequency and embryo mortality.We observed pericardial and yolk sac edema.Conclusion Optimized conditions can achieve complete inhibition of pigmentation for generating transparent zebrafish while avoiding toxic effects of PTU treatment.

    1-phenyl-2-thiourea(PTU);Zebrafish;Heart rate;Hatching rate

    R965.1 R332

    A

    1671-7856(2012)09-0021-05

    10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.005

    2012-08-25

    國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2009ZX09501-034);國家973計劃(2011CB503803)。

    張利軍,男,博士生,研究方向:藥物安全性評價。

    彭雙清,研究員,博士生導(dǎo)師,研究方向:藥物安全性評價;Email:pengsq@hotmail.com。

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