普通環(huán)境長爪沙鼠呼吸道菌群的分離鑒定

馮育芳，邢 進，王 吉，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

普通環(huán)境長爪沙鼠呼吸道菌群的分離鑒定

馮育芳，邢 進，王 吉，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050)

目的 調(diào)查普通環(huán)境長爪沙鼠呼吸道細菌及支原體攜帶情況，為制定長爪沙鼠微生物學(xué)等級標準提供依據(jù)。方法 對普通環(huán)境飼養(yǎng)的65只長爪沙鼠進行解剖，取氣管分泌物接種血瓊脂，分別放入普通培養(yǎng)箱和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分離菌株后同時進行生化分析和PCR測序鑒定，以期準確判斷分離菌株所屬菌屬;氣管浸液提取DNA，用支原體特異性引物進行PCR檢測，并分別計算檢出率。結(jié)果 本研究共檢出22種細菌及支原體。不同細菌、支原體感染率相差很大，陽性率在1.5%(1/65)到64.6%(42/65)之間，其中部分細菌為大鼠和小鼠致病菌。結(jié)論 本研究為長爪沙鼠的微生物學(xué)等級標準的制定提供了參考數(shù)據(jù)。

長爪沙鼠;呼吸道菌群;普通環(huán)境;分離鑒定

長爪沙鼠(Meiiones unguiculataus Milme- Edwauds)亦稱長爪沙土鼠，在動物分類學(xué)上屬于哺乳綱，嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬;分布在內(nèi)蒙古自治區(qū)及其毗鄰的省區(qū)，包括河北省北部、山西、陜西、寧夏、青海等地的草原地帶，蒙古人民共和國和蘇聯(lián)布里亞特地區(qū)也有分布，目前用于研究的沙鼠均來自同一沙鼠群。

長爪沙鼠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域作為實驗動物已有30多年的歷史，使用量雖比大鼠、小鼠、豚鼠和倉鼠少，但其獨特的解剖學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)特征對于某些領(lǐng)域的研究具有重要價值，是其他大、小鼠無法比擬的。而且，有研究表明，長爪沙鼠是一種“多能”性的實驗動物，具有非常重要開發(fā)潛能。然而，目前尚未制定相應(yīng)的長爪沙鼠微生物學(xué)等級標準，這在一定程度上制約和阻礙了長爪沙鼠作為實驗動物的廣泛使用。因此，本研究對普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠呼吸道菌群進行了分離鑒定，了解長爪沙鼠的菌群攜帶情況，為長爪沙鼠微生物學(xué)等級標準的建立提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供的長爪沙鼠65只，體重20 g～60 g之間，3月齡以上，雄性32只，雌性33只;實驗動物生產(chǎn)許可證為 SCXK(京)2000－0012。

1.1.2 培養(yǎng)基:血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(blood agar base No.2，CM0271)購自英國 Oxiod公司;新鮮羊血購自個體供應(yīng)商。

1.1.3 生化鑒定試劑:革蘭氏陰性菌鑒定板(NMIC/ID-4)、革蘭氏陽性菌鑒定板(PMIC/ID-55)及相關(guān)鑒定配套試劑購自美國BD公司。革蘭氏染色液、API 20E腸道菌鑒定系統(tǒng)(Ref.20100)、API 20 NE非腸道菌鑒定系統(tǒng)(Ref.20050)、API STAPH葡萄球和微球菌鑒定系統(tǒng)(Ref.20500)、API 20 STREP鏈球菌及有關(guān)種類的鑒定系統(tǒng)(Ref.20600)購自生物梅里埃公司(Biomerieux)。生化管購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 PCR相關(guān)試劑及引物:細菌DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司;HS Taq酶購自大連寶生物工程公司，引物合成自上海生物工程公司;細菌16SrRNA 片段擴增引物［1］FD1:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，RP2:5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’。支原體檢測引物［2，3］GP0-3:5’-GGG AGC AAA CAG GAT TAG ATA CCC T-3’，MGSO:5’-TGC ACC ATC TGT CAC TCT GTT AAC CTC-3’，擴增產(chǎn)物為 270 bp。

1.1.5 主要儀器:隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海安亭，WGP-600)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Series，8000DH)，全自動細菌檢定儀(BD，Phoenix 100)，PCR 儀(Biorad Mycycler)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng):眼球采血后采用安死術(shù)處死沙鼠，嚴格按照無菌操作要求解剖動物，用一次性接種環(huán)刮取呼吸道分泌物，接種兩個血瓊脂培養(yǎng)基。其中，一個置5%二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h，另一個置普通培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)長出菌落的大小、形態(tài)、顏色、溶血類型等進行分類，然后對每一種類的細菌純培養(yǎng)，革蘭氏染色，以確定下一步的分離鑒定方法。

1.2.2 細菌的鑒定:革蘭氏染色分類后的細菌分別用不同的鑒定條進行鑒定，用分析軟件分析結(jié)果。根據(jù)軟件提示補充相應(yīng)的生化項目，結(jié)合16S rRNA的測序結(jié)果得出結(jié)論;對于部分不太確定的菌株用全自動細菌鑒定儀進行檢測，同時結(jié)合16S RNA的測序結(jié)果進行分析得出最終結(jié)論。

2 結(jié)果

2.1 長爪沙鼠呼吸道細菌種類的初步確定

根據(jù)菌落形態(tài)、芽孢鑒定試驗及染色鏡檢結(jié)果，初步確定長爪沙鼠呼吸道含有21種細菌，其中，G+球菌10株、G－球菌1株、G+桿菌4株、G－桿菌6株，見表1。

表1 普通環(huán)境長爪沙鼠呼吸道細菌種類的初步確定Tab.1 Identification of respiratory tract flora in the Mongolian gerbils

2.2 長爪沙鼠呼吸道菌群分離鑒定結(jié)果

根據(jù)生化試驗結(jié)果，結(jié)合菌落的生長表現(xiàn)、PCR測序鑒定及染色特性綜合分析，可確定21種長爪沙鼠呼吸道菌群的種屬，在此基礎(chǔ)上統(tǒng)計不同菌株的檢出率，不同細菌感染率相差很大，陽性率在1.5%(1/65)到64.6%(42/65)之間，見表2。

2.3 長爪沙鼠呼吸道菌群致病性分析

為了了解所分離菌株的致病性，參考相關(guān)文獻，對檢出的21種呼吸道細菌的致病性(包括對人致病性和對動物致病性)進行分析，對表2的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。在檢出的21種呼吸道菌中包含致病菌5種，平均檢出率為4.31%;條件致病菌13種，平均檢出率為19.29%;非致病菌為3種，平均檢出率為20.00%。而且，為了了解需排除動物的比率，我們計算了包含各類細菌動物占全部被檢動物的百分率，見表3。

表2 長爪沙鼠呼吸道菌群分離鑒定結(jié)果Tab.2 Isolation of respiratory tract flora from the Mongolian gerbils

表3 長爪沙鼠呼吸道菌群致病性分析Tab.3 The pathogenicity analysis of respiratory tract flora of Mongolian gerbil

2.4 呼吸道菌群在長爪沙鼠不同個體間的差異

我們還分析了不同的呼吸道菌在長爪沙鼠不同個體間的差異，通過對性別、月齡、體重等因素分組，分析發(fā)現(xiàn)，呼吸道菌群與上述因素沒有明顯相關(guān)性，不同個體間的菌群分布未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律性。

2.5 長爪沙鼠呼吸道支原體檢測結(jié)果

PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，長爪沙鼠氣管浸液中含有支原體，陽性率為70.77%(46/65)，結(jié)果見圖1。

3 討論

長爪沙鼠已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的眾多領(lǐng)域，雖然較大鼠、小鼠的使用量要少很多，但是由于其自身不可替代的一些解剖生理和生物學(xué)特點，是一種具有明顯應(yīng)用優(yōu)勢和發(fā)展前景的實驗動物種類［4，5］，在寄生蟲病學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)和腦血管疾病、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［1，6－8］，但對其呼吸道細菌情況調(diào)查的報道很少。Solomon等［9］從三個不同群體的長爪沙鼠的鼻咽部均分離到了木糖葡萄球菌。杜小燕等［10］發(fā)現(xiàn)銀川市和呼和浩特地區(qū)的野生長爪沙鼠分別攜帶了12種和8種細菌，屏障環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠攜帶了7種細菌。本研究使用兩種不同的培養(yǎng)條件對長爪沙鼠呼吸道分泌物攜菌情況進行了研究，結(jié)果表明，普通環(huán)境中飼養(yǎng)長爪沙鼠呼吸道攜帶了21種細菌，其中G+球菌11株、G+桿菌2株、G－桿菌8株。在此基礎(chǔ)上，進一步對上述細菌鑒定到屬，并計算了檢出率。

圖1 長爪沙鼠支原體檢測結(jié)果注:M代表50 bp的marker;－代表陰性對照;+代表陽性對照，陽性片段大小為270 bpFig.1 Detection results of mycoplasma from the respiratory tract of the Mongolian gerbilsNote:M:50 bp marker;－:negative control;+:positive control;The size of positive fragments was 270 bp.

本研究共檢出呼吸道細菌21種，多于Solomon等［9］和杜小燕等［10］人的報告結(jié)果。原因之一是，本研究為盡可能全面的了解長爪沙鼠呼吸道菌群情況，防止目的菌株的漏檢，使用了兩種不同的培養(yǎng)方式，包括普通培養(yǎng)箱和5%CO2培養(yǎng)箱，增加了細菌檢出效率，有效避免了可能存在的漏檢。

從不同菌株的檢出率來看，嗜肺巴斯德桿菌(24.61%)、豬放線桿菌(64.61%)、孔氏葡萄球菌(24.61%)和綠色氣球菌(63.08%)等正常或條件致病菌分布較廣，而多殺巴斯德菌(多殺亞種)(6.15%)、多殺巴斯德菌(敗血亞種)(7.69%)、豬鏈球菌(3.08%)等致病菌檢出率較少，說明控制環(huán)境條件對長爪沙鼠的種群凈化具有重要的意義。但值得注意的是，嗜肺巴斯德桿菌(24.61%)檢出率較高，雖然是條件致病菌，但這是SPF級大鼠和小鼠均要求排除的細菌，應(yīng)引起重視。

對照現(xiàn)行國家標準(GB 14922.2－2011)，本研究檢出的多殺巴斯德菌是清潔級豚鼠、地鼠、兔子必須檢測和排除的，嗜肺巴斯德菌是SPF級嚙齒類動物必須檢測和排除的。支原體是清潔級大鼠和小鼠必須檢測和排除的。與國外標準相比較，鼠放線桿菌是國際實驗動物科學(xué)委員會(ICLAS)要求排除的;杰克森實驗室(JAX)需要排除鏈球菌屬。

此外，本研究檢出的多殺巴斯德菌、豬鏈球菌是一些重要的病原菌，可能對飼養(yǎng)人員、實驗人員或其他動物產(chǎn)生危害，應(yīng)考慮列為清潔級長爪沙鼠應(yīng)排除的細菌。對本研究檢出的13種條件致病菌，應(yīng)根據(jù)其對動物或人類的危害選其具有代表性的細菌，列為SPF級長爪沙鼠應(yīng)排除的細菌。本研究為長爪沙鼠的微生物學(xué)等級標準的制定提供了參考數(shù)據(jù)。

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Isolation and Identification of Respiratory Tract Flora of Mongolian Gerbils from Conventional Facility

FENG Yu-fang，XING Jin，WANG Ji，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
(National Institute of Food and Drug Control，Beijing 100050，China)

Objective To investigate the respiratory tract flora and mycoplasma status in Mongolian gerbils from a conventional facility，and provide basic information for the developing microbiologic testing standards of gerbils.Methods Sixty-five gerbils from conventional facility of Capital Medical University were dissected to obtain the tracheal secretion，and then the samples were seeded in blood agar base，cultured in common or 5%CO2incubator for 48 h，separately.In order to accurately identify the genus to which the isolated strain belongs，biochemical analysis and PCR sequencing were performed.On the other hand，DNA was isolated from tracheal lixivium，and mycoplasma DNA was amplified by specific primer.The detection rate was calculated.Results In this study，21 kinds of bacteria and mycoplasma were detected in the tracheas of these mongolian gerbils.The positive rates of different bacterial and mycoplasma infection were varying greatly，between 1.5%(1/65)to 64.6%(42/65)，among which，some bacteria were pathogenic to mice and rats.Conclusion This study provides reference information for the development of microbiological standards of Mongolian gerbils.

Mongolian gerbils; Respiratory tractflora; Bacteria; Mycoplasma; Conventionalfacility;Isolation;Identification

R33

A

1671-7856(2012)10-0050-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.010.012

2012-09-25

野生動物人工種群的生物凈化及相關(guān)疾病動物模型的建立與評價(2009BA183B02)。

馮育芳(1981－)，女，助理研究員，碩士，研究方向:實驗動物微生物檢測，E-mail:fyf307@126.com。

賀爭鳴(1957－)，男，研究員，博士，研究方向:實驗動物微生物學(xué)，E-mail:hezm@nicpbp.org.cn。