自制中藥正元蕓生滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)研究

王淑霞 支晨陽 高冬梅 戈亞平 楚建設(shè) 高雁

糖尿病患者因糖代謝障礙致全身各組織器官的微血管發(fā)生病變，糖尿病性視網(wǎng)膜病變(簡稱糖網(wǎng))是其最常見的并發(fā)癥。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科專業(yè)委員會(huì)眼底病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)，分為單純型和增殖型。對(duì)于增殖型患者臨床中常采用激光和手術(shù)治療，而對(duì)于單純型患者，臨床多用藥物治療，其療效不甚明確。在前期研究中，我們研制的正元蕓生滴丸的提取工藝、滴丸的制備均符合臨床要求及藥典規(guī)定，我們繼續(xù)對(duì)其成分含量和穩(wěn)定性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 正元蕓生滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1.1.1 性狀:本品應(yīng)為棕褐色滴丸，表面光潔，不得粘連。

1.1.2 薄層鑒別

1.1.2.1 當(dāng)歸 取本品3 g，加乙醚20 ml，超聲15 min，濾過，低溫蒸去乙醚，殘?jiān)么姿嵋阴? ml溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液再取缺當(dāng)歸樣品，同法制備陰性樣品溶液。吸取上述三種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷一乙酸乙醋(9∶1)為展開劑展開、取出、晾干，置紫外光燈(365 nm)下，觀測(cè)對(duì)比三種溶液色譜。

1.1.2.2 川芎 取本品5 g，加水50 ml使溶散，加乙醚提取3次，每次50 ml，水液備用，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)勇确? ml使溶解，作為供試品溶液。另取川芎對(duì)照藥材0.5 g，加乙醚30 ml超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)勇确?.5 ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取缺川芎樣品，同法制備陰性樣品溶液。吸取上述各4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開、取出、晾干方法同前，置紫外光燈(365 nm)下檢視。觀測(cè)對(duì)比三種溶液色譜。

1.1.2.3 桃仁 取本品4 g，加甲醇20 ml，密塞，超聲提取20 min，濾過，濾液水浴濃縮至1 ml，作為供試品溶液;另取桃仁對(duì)照藥材2 g、缺桃仁的陰性樣品4 g，同法分別制桃仁對(duì)照藥材溶液和陰性樣品溶液。吸取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(6∶4∶0.3)為展開劑展開、取出、晾干，噴以5%香草醛顯色劑觀察。

1.1.2.4 紅花 取本品10 g，用80%的丙酮水50 ml冷浸提取4 h后濾過，殘?jiān)m(xù)用80%的丙酮水20 ml冷浸提取2 h后濾過，合并2次濾液，55℃下0.1 MPa真空蒸干，殘?jiān)?0 ml 70%的乙醇水超聲溶解，上NKA大孔吸附樹脂柱(130 g，3.5 cm×20 cm)，用300 ml水洗脫，棄去水洗液，再用500 ml的30%乙醇水洗脫，收集30%乙醇水洗脫液，55℃下0.1 MPa真空蒸干，殘?jiān)?0%丙酮水溶解并定容至5 ml，作為供試品溶液。按處方除去紅花配置成紅花陰性樣品，同上法制成陰性溶液。另取紅花對(duì)照藥材0.5 g，以5 ml 80%丙酮水分3次于振蕩機(jī)中中速振搖提取20 min，合并上清液濃縮并定容至5 ml，作為對(duì)照藥材溶液。參照方法同上，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，以甲醇-36%鹽酸(1∶1)為展開劑展開、取出、晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。

1.1.2.5 牛膝 對(duì)照品溶液的配制:取齊墩果酸對(duì)照品，加乙醇制成1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。樣品溶液的配制:取本品約11 g，加乙醇30 ml，加熱回流40 min，靜置，濾過，取濾液，加鹽酸3 ml，加熱回流1 h，濃縮至5 ml，加水10 ml，用石油醚(60℃ ～90℃)20 ml振搖提取，提取液蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液?？瞻兹芤旱呐渲?按處方工藝提取并制備牛膝缺樣空白樣品，取適量(相當(dāng)于本品11 g)，按樣品溶液制備方法得到缺樣空白溶液。分別吸取供試品溶液、缺樣空白溶液和對(duì)照品溶液各10 μl，分別點(diǎn)樣于同一硅膠H薄層板上，以氯仿2甲醇(40∶1)為展開劑展開、取出、晾干。噴以磷鉬酸試液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰，觀察對(duì)比三種溶液色譜。

1.1.2.6 生地黃 取本品3 g，加70%乙醇30 ml超聲20 min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml溶解，過濾后加硫酸2 ml，攪勻。用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20 ml，棄去堿液，繼用正丁醇飽和的水洗至中性，正丁醇水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，得供試品溶液。取生地黃藥材粉末3 g，100 ml水回流1 h，過濾濃縮至50 ml用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次20 ml，棄去堿液，繼用正丁醇飽和的水洗至中性，正丁醇水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，得對(duì)照藥材溶液。取除生地黃以外的其他藥材，按照樣品制備工藝制成陰性對(duì)照樣品，取陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液處理方法制成陰性對(duì)照溶液。吸取上述溶液各20 μl，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(20∶2∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5%三氯化鋁溶液，紫外光燈(365 nm)下檢視，觀察對(duì)比三種溶液色譜。

1.1.3 含量測(cè)定

1.1.3.1 色譜條件 色譜柱:ReliaSil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1% 磷酸(13:87);流速:0.7 ml/min;檢測(cè)波長:233 nm;柱溫:室溫。

1.1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品6.25 mg，置5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 ml含0.25 mg芍藥苷)。

1.1.3.3 供試品溶液的制備 取本品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，放置2 h，超聲處理1 h，冷卻至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液20 ml，置于100 ml溶量瓶中，用甲醇定容，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液。

1.1.3.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 取缺赤芍的樣品2.0 g，照供試品溶液的制備項(xiàng)下同法操作。

1.1.3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液(0.25 mg/ml)2、4、6、8、10 μl分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定，根據(jù)對(duì)照品的峰面積積分值對(duì)芍藥苷的進(jìn)樣量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.1.3.6 方法學(xué)考察 ①精密度試驗(yàn):分別吸取5 μl的對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)量計(jì)算其峰值面積。②穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液 5 μl，于 0、2、4、24、36 h 分別依法測(cè)定。③重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn):精密稱取同一批樣品5份，按供試品溶液的制備和測(cè)試方法測(cè)定峰面積RSD。④回收率試驗(yàn):精密稱取已知樣品含量(8.79 mg/g)的樣品5份，分別加入芍藥苷對(duì)照品一定量，按正文2項(xiàng)下操作，測(cè)定并根據(jù)樣品含量及芍藥苷對(duì)照品加入量，計(jì)算回收率。

1.1.3.7 樣品測(cè)定 經(jīng)過多次試驗(yàn)，現(xiàn)本品中芍藥苷含量暫定為每克不得低于8.47 mg。

1.1.4 檢查 參照《中華人民共和國藥典》制定本品的檢查項(xiàng)目。本次實(shí)驗(yàn)考察的檢查項(xiàng)主要包括溶散時(shí)限(應(yīng)在30 min內(nèi)全部崩解并通過篩網(wǎng))和微生物限度(細(xì)菌總數(shù)≤1 000個(gè)/g，真菌總數(shù)≤100個(gè)/g，大腸埃希菌和活螨不得檢出)。

1.2 正元蕓生滴丸穩(wěn)定性研究 將三批樣品采用塑料瓶包裝，在室溫條件下留樣觀察(25℃ ±2℃，相對(duì)濕度RH60% ±5%)，當(dāng)月考察1 次，以后第1、2、3、6、9、12 月依次考察一次，考察項(xiàng)目為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)鍵項(xiàng)目。

1.2.1 性狀 本品應(yīng)為棕褐色滴丸，表面光潔，不得粘連。

1.2.2 鑒別 按本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的鑒別項(xiàng)下方法進(jìn)行薄層色譜鑒別試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)表明，三批供試品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，供試品均在與對(duì)照藥材對(duì)應(yīng)處有相應(yīng)斑點(diǎn)。

1.2.3 檢查 參照《中華人民共和國藥典》制定本品的檢查項(xiàng)目。本次實(shí)驗(yàn)考察的檢查項(xiàng)同一。

1.2.4 含量測(cè)定 按本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的“含量測(cè)定”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定不同時(shí)期樣品中芍藥苷的含量，本品中芍藥苷含量應(yīng)每克不得低于8.47 mg。

2 結(jié)果

當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、生地黃和牛膝薄層鑒定結(jié)果:在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照溶液無干擾;三批樣品穩(wěn)定性研究外觀性狀考察結(jié)果:三批供試品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，均為棕褐色滴丸，表面光潔，不粘連。

表1 三批樣品穩(wěn)定性研究溶散時(shí)限考察結(jié)果

三批樣品穩(wěn)定性研究微生物限度考察結(jié)果:實(shí)驗(yàn)表明，三批供試品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，溶散時(shí)限和微生物限度均符合規(guī)定。

表2 三批樣品穩(wěn)定性研究芍藥苷含量考察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)表明，三批供試品在 0、1、2、3、6、9、12 月考核，樣品含量均符合規(guī)定。

在含量測(cè)定研究中，芍藥苷對(duì)照品進(jìn)樣量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果:Y=8.3421×104X+3.1723×103，r=0.99996。表明:芍藥苷在0.05～0.25 μg之間呈良好的線性關(guān)系;精密度試驗(yàn)中測(cè)得其峰面積RSD為1.38%。穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)得峰面積RSD為1.03%，芍藥苷在30 h內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中測(cè)得其峰值面積RSD為1.74%?；厥章试囼?yàn)中測(cè)得其平均回收率為98.96%，RSD為0.8%(n=5)。

3 討論

正元蕓生滴丸是有效治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥滴丸［1-4］，在前期的實(shí)驗(yàn)研究中我們證實(shí)了該制劑的提取工藝、滴丸的制備均符合臨床要求及藥典規(guī)定。本項(xiàng)研究采用薄層色譜法對(duì)制劑中的當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、牛膝、桔梗、生地黃進(jìn)行了定性鑒別;采用高效液相色譜法對(duì)制劑中的芍藥苷進(jìn)行了定量分析。研究結(jié)果:薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾;芍藥苷在0.05～0.25 μg之間呈良好的線性關(guān)系。平均回收率為98.96%，RSD為0.8%(n=5)。研究結(jié)果證實(shí)本方法實(shí)用可靠，可以用于正元蕓生滴丸的質(zhì)量控制。

［1］于蘭英，于紅.正元蕓生膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性靜脈阻塞的影響.長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，21(4):42.

［2］辛浩蓉，支洪峰.正元蕓生滴丸治療單純型糖尿病性視網(wǎng)膜病變療效觀察.長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25(6):877.

［3］支洪峰，高冬梅，劉馨.正元蕓生膠囊治療視網(wǎng)膜靜脈阻塞臨床觀察.中國社區(qū)醫(yī)師，2005，21(12).

［4］雷載權(quán).中藥學(xué).上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994:92-94.