力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道的影響

薄冰常蕓

1 上海體育學(xué)院（上海 200438）

2 國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所

·基礎(chǔ)研究·

力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道的影響

薄冰1，2常蕓2

1 上海體育學(xué)院（上海 200438）

2 國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所

目的：探討2周力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道亞基HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達(dá)及通道電流密度的影響。方法：健康雄性SD大鼠180只，8周齡，體重（220±8）g，共分9組，每組20只，包括安靜對(duì)照組（C組）1組、一次力竭組（O組）4組和反復(fù)力竭組（R組）4組。安靜對(duì)照組不施加任何運(yùn)動(dòng)影響，反復(fù)力竭各組大鼠尾部負(fù)重為體重的3%，每天1次力竭游泳，每次運(yùn)動(dòng)時(shí)間控制在2小時(shí)左右，每周運(yùn)動(dòng)6天，共2周，一次力竭組大鼠在正常喂養(yǎng)2周后進(jìn)行一次力竭游泳運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方案同反復(fù)力竭組。運(yùn)動(dòng)組大鼠分別于運(yùn)動(dòng)后即刻、4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)不同時(shí)相取材，一次力竭運(yùn)動(dòng)各組分別命名O-0h、O-4h、O-12h、O-24h，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)各組分別命名R-0h、R-4h、R-12h、R-24h。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定HCN通道亞基HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達(dá)變化，細(xì)胞急性分離及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定通道電流密度變化，觀察力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)細(xì)胞膜上HCN通道的影響。結(jié)果：（1）與對(duì)照組相比，一次力竭組O-0h組HCN1、HCN4mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P<0.05，P<0.01），O-4h組HCN1、HCN4顯著升高（P<0.01，P<0.05）；反復(fù)力竭組R-0h與R-4h組HCN1顯著下降（P<0.01，P<0.01）；反復(fù)力竭各組HCN2、HCN4 mRNA表達(dá)顯著下降（P< 0.01）。（2）反復(fù)力竭各時(shí)相組HCN通道電流密度顯著低于對(duì)照組及一次力竭組。結(jié)論：兩周力竭運(yùn)動(dòng)可引起竇房結(jié)HCN通道亞基HCN2及HCN4 mRNA表達(dá)下降，通道If電流密度減少，這可能成為運(yùn)動(dòng)引發(fā)竇房結(jié)功能障礙的離子通道機(jī)制之一。

力竭運(yùn)動(dòng)；竇房結(jié)；超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道

竇房結(jié)（SAN）細(xì)胞以舒張期緩慢自動(dòng)除極為特征，即在動(dòng)作電位末期自發(fā)除極至下一動(dòng)作電位的閾電位，這也是竇房結(jié)細(xì)胞生成自發(fā)起搏活動(dòng)的電學(xué)基礎(chǔ)［1］，同時(shí)也是建立在起搏細(xì)胞膜上多種離子通道共同活動(dòng)的基礎(chǔ)之上。在參與起搏活動(dòng)產(chǎn)生及調(diào)節(jié)的多種機(jī)制中，HCN通道攜帶的“funny電流”作為起搏電流，發(fā)揮著極其重要的作用［2，3］。

1977 年，Normo等［4］在對(duì)兔竇房結(jié)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)一種特性與眾不同的電流，將其命名為“funny電流 （funny current，If）”。 隨著研究的不斷深入，DiFrancesco等［5］發(fā)現(xiàn)該電流在竇房結(jié)細(xì)胞超級(jí)化時(shí)被激活，因而該電流也稱(chēng)為超級(jí)化激活電流，攜帶這一電流的通道被稱(chēng)為超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門(mén)控通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels，HCN channel）。If是由Na+和K+組成的混合型陽(yáng)離子電流，稱(chēng)之為“funny電流”，是因?yàn)樵谏項(xiàng)l件下，If的激活是通過(guò)超級(jí)化電壓階躍至接近細(xì)胞靜息電位的內(nèi)向電流，約為-40 mV，這表現(xiàn)出If的開(kāi)放與靜息期膜電位的關(guān)系。基于這一特性，Brown等［6］認(rèn)為If參與靜息電位并引起細(xì)胞膜動(dòng)作電位除極；If的最大激活電位在-100mV，完全活化電流―電壓關(guān)系曲線顯示反轉(zhuǎn)電位接近-10 mV，表明If在細(xì)胞舒張期去極化生成中的重要作用。因?yàn)閮?nèi)向電流的激活可引起去極化，If的激活電壓與竇房結(jié)細(xì)胞舒張期去極化電壓（接近-40 mV到-65 mV）重疊，因此，If適宜成為舒張期去極化的“起搏”電流。

從小鼠［7］、兔［8］和人［9］中克隆出4種編碼生成If電流的HCN通道基因亞型，命名為HCN1-4。每種亞型都含有6個(gè)跨膜區(qū)域和1個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域（cyclic nucleotide-binding domain，CNBD）。HCN通道的4種基因亞型在哺乳動(dòng)物心臟組織中均被發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)組織的主要亞型是HCN1、HCN2和HCN4，負(fù)責(zé)形成攜帶If電流的通道，其中，最主要的HCN轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是HCN4。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HCN通道改變可導(dǎo)致竇房結(jié)產(chǎn)生自發(fā)起搏活動(dòng)及其頻率異常［2，3］，但運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)于竇房結(jié)細(xì)胞HCN通道的影響卻未見(jiàn)報(bào)道，因此，本文即以HCN通道亞基mRNA表達(dá)及通道電流密度為切入點(diǎn)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞急性分離及全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)細(xì)胞膜上HCN通道的影響，為進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)性竇房結(jié)功能障礙及運(yùn)動(dòng)性心律失常提供實(shí)驗(yàn)論據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康雄性SD大鼠180只，8周齡，體重（220±8）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)2011-0001。動(dòng)物提取后，隨機(jī)分為9組，每組20只，包括安靜對(duì)照組1組、一次力竭組4組和反復(fù)力竭組4組。運(yùn)動(dòng)組大鼠分別于運(yùn)動(dòng)后即刻、4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)不同時(shí)相取材，一次力竭運(yùn)動(dòng)各組大鼠分別以O(shè)-0h、O-4h、O-12h、O-24h命名，反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)各組大鼠分別以R-0h、R-4h、R-12h、R-24h命名，以觀察運(yùn)動(dòng)結(jié)束后竇房結(jié)HCN通道亞基mRNA表達(dá)及電流密度變化與時(shí)間的關(guān)系。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（18±2）℃，光照時(shí)間12小時(shí)，相對(duì)濕度為40%～50%。本實(shí)驗(yàn)在國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

安靜對(duì)照組不施加任何運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)入動(dòng)物房后先適應(yīng)3天，然后進(jìn)行2天適應(yīng)性游泳運(yùn)動(dòng)（20分鐘/次）。反復(fù)力竭各組大鼠尾部負(fù)重約為體重的3%，進(jìn)行2周力竭游泳，每周運(yùn)動(dòng)6天，每天1次，每次運(yùn)動(dòng)2個(gè)小時(shí)左右。每次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，用干毛巾迅速擦干大鼠身上水分，電吹風(fēng)把毛吹干后，放回籠中休息。并在最后一次力竭游泳后即刻、4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)不同時(shí)相取材。一次力竭運(yùn)動(dòng)各組大鼠正常喂養(yǎng)2周后，進(jìn)行一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)，尾部負(fù)重約為體重的3%，并在力竭運(yùn)動(dòng)后即刻、4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)不同時(shí)相取材。力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas［10］的報(bào)道，即經(jīng)過(guò)10s后動(dòng)物仍不能返回水面，并且撈出后置于平面不能完成翻正反射。

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.3.1.1 大鼠心臟竇房結(jié)組織取材

使用10%水合氯醛（1ml/100g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠結(jié)膜反射、翻正反射消失后，仰臥固定，75%酒精消毒胸腹部皮膚。打開(kāi)胸腔后游離出上腔靜脈，沿離心方向約0.5 cm處剪斷；沿著界溝行切口打開(kāi)右心房進(jìn)入腔靜脈，由靠近并平行于界嵴的腔靜脈區(qū)域分離出一條形組織，其中含有主要起搏細(xì)胞。

1.3.1.2 大鼠心臟竇房結(jié)總RNA提取

采用TRIzol法提取心臟竇房結(jié)總RNA。將收集管中的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到含有1ml TRIzolReagent的EP管中，顛倒混勻，室溫靜置5～10 min，加入200 μl氯仿，手動(dòng)劇烈震蕩混勻15 s，室溫靜置2～3 min，4℃、12000轉(zhuǎn)/min離心10 min，轉(zhuǎn)上層水相（500～600 μl）于另一新1.5m l EP管中，加等體積異丙醇（500～ 600μl），混勻，室溫放置30min。棄上清，加DEPC水溶液溶解，-80℃保存。

1.3.1.3 逆轉(zhuǎn)錄RNA合成為cDNA

根據(jù)樣品數(shù)量按下列反應(yīng)體系配制反應(yīng)混合液，引物Oligo（dT），10 pmol/μl（2μl）、10 mM dNTP mix（4μl）、H2O（24μl）共30μl。將混合液分裝到0.2 ml PCR管中，分別加入2μl RNA（約2μg左右），70℃變性5min，冰上速冷2min，離心將溶液收集至管底。按順序根據(jù)下列反應(yīng)體系配置混合反應(yīng)液：5×PCR buffer（10μl）、DTT（6μl）、M-MLV RT（酶）（MMLV-Promega）（2μl），共18μl。將上述混合物分裝到上述0.2 ml PCR管中，共計(jì)50μl體系。42℃延伸50min，95℃保溫5min終止反應(yīng)。cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)搜索Genbank查找基因序列，應(yīng)用Primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其特異性，所有引物擴(kuò)增目的基因片斷長(zhǎng)度均小于150 bp。設(shè)計(jì)的引物由Invitrigin公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR基因引物序列

1.3.1.5 SYBR GREEN熒光定量PCR

將cDNA和引物解凍，取定量PCR用的96孔板，按如下成分加入：RealqPCR Master Mix（12μl）、引物F/R （上下游引物終濃度均為10 pmol/μl）（0.5/ 0.5μl）、H2O （11μl）。最后加入相對(duì)應(yīng)的cDNA（1 μl），共25μl，封膜。打開(kāi)ABI7900HT定量PCR儀，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件如下：95℃10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，（生成擴(kuò)增曲線）；95℃ 15 s，60℃60 s，95℃15 s（生成溶解曲線），上述反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。

1.3.1.6 mRNA結(jié)果分析

觀察溶解曲線，判斷PCR特異性；以2-△△Ct作為計(jì)算公式，分析各組mRNA表達(dá)差異，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL軟件中單因素方差分析（ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的顯著性差異采用SNK法，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

1.3.2 大鼠竇房結(jié)細(xì)胞膜HCN通道電流密度測(cè)定

1.3.2.1 大鼠竇房結(jié)細(xì)胞急性分離

［11，12］，將分離后的心臟行主動(dòng)脈逆行插管，固定后懸掛于Langendorff灌流裝置上，以普通Tyrode液灌流3～5 min，灌流速度7 ml/min，靜水壓70 cmH2O，溫度37℃。待心腔內(nèi)殘血全部流出后，將普通Tyrode液換成無(wú)Ca2+-Tyrode液以消除自發(fā)節(jié)律。從灌流裝置上取下心臟，在無(wú)Ca2+-Tyrode液中沿著界溝行切口打開(kāi)右心房進(jìn)入腔靜脈，由靠近并平行于界嵴的腔靜脈區(qū)域分離出一條形組織，其中含有主要起搏細(xì)胞。分離的竇房結(jié)組織置于2ml離心管中，管中充滿(mǎn)2ml含有0.85mg/ml Collagenase II、0.4 mg/ ml Elastase type II-A和13.5μl/ml Protease（1 mg/ 100μl）的無(wú)Ca2+-Tyrode液，并置于37℃水浴20～23 min。最后，將條形組織轉(zhuǎn)移至含有KB液的培養(yǎng)皿中，更新3次KB液以去除酶液。用尖端直徑2mm的玻璃吸管輕柔吹打KB液7～9min，使用200目微孔不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾去除結(jié)締組織和未消化細(xì)胞，濾液于室溫下靜置30min以備用。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度在18～28℃之間，實(shí)驗(yàn)中所有灌流液均用醫(yī)用純氧飽和并在灌流過(guò)程中持續(xù)通氧。

1.3.2.2 全細(xì)胞膜片鉗記錄大鼠竇房結(jié)HCN通道電流密度

取出完成貼壁的竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于倒置顯微鏡下，用氧飽和的電極外液灌流，灌流速度約1 ml/min，沖去死亡細(xì)胞碎片。選取處于靜息狀態(tài)下的表面光滑、橫紋清晰、折光好、立體感強(qiáng)的單個(gè)SAN細(xì)胞為研究對(duì)象。本研究采用硅酸鹽硬質(zhì)玻璃制作記錄電極 （武漢華中科大儀博生命科學(xué)儀器有限公司），經(jīng)P-97（Sutter美國(guó)）水平拉制儀兩步拉制而成。電極充灌電極液后電阻為2.5～3.5MΩ。將玻璃微電極安置于膜片鉗放大器（HEKA EPC10德國(guó)）前端探頭夾持器上，然后緩慢調(diào)節(jié)微操儀推動(dòng)電極尖端接觸到細(xì)胞膜，當(dāng)電阻值達(dá)到1～2GΩ時(shí)即形成高阻封接，此時(shí)補(bǔ)償快電容，然后采用脈沖式負(fù)壓吸引，將封接吸入電極尖端內(nèi)的細(xì)胞膜片吸破，即“破膜”，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相溝通，形成全細(xì)胞記錄狀態(tài)，示波器上顯示跨細(xì)胞膜電容電流，隨后進(jìn)行慢電容補(bǔ)償（C-Slow Capacitance compensation），并記錄細(xì)胞膜電容值。實(shí)驗(yàn)刺激信號(hào)由pulse+pulsefit8.6軟件控制，通過(guò)Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導(dǎo)入細(xì)胞，產(chǎn)生的電流信號(hào)經(jīng)EPC10放大、濾波，將記錄的原始數(shù)據(jù)圖像存入計(jì)算機(jī)硬盤(pán)。在pulse8.6應(yīng)用程序中打開(kāi)原始數(shù)據(jù)文件，找出各道指令電壓下的電流圖，測(cè)定其電流值。實(shí)驗(yàn)溫度為18～28℃。

1.3.2.3 溶液配制

正常臺(tái)氏液（mmol/L）：NaCl 140，KCl 5.4，HEPES 10，MgCl21，CaCl22，Glucose 10， （pH 7.4 NaOH）；無(wú)鈣臺(tái)氏液 （mmol/L）：NaCl 140，KCl 5.4，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，（pH 7.4 NaOH）；KB液 （mmol/L）：L-谷氨酸120，KOH 80，EGTA 0.3，KCl 20，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，（pH 7.4 KOH）。消化酶液（mmol/L）：5m l無(wú)鈣臺(tái)氏液中加入0.85mg/ ml CollagenaseⅡ、0.4mg/ml Elastase type II-A和13.5 μl/m l Protease（1mg/100μl）；HCN通道電極內(nèi)液（mmol/ L）：K-aspartate 110，KCl 20，MgCl21，Na2ATP 5，Na-GTP 0.1，HEPES 10，Na-phosphocreatine 5，EGTA 5，（pH 7.3 KOH），0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后分裝于1 mlEP管，-20℃冰箱儲(chǔ)存；HCN通道電極外液（mmol/ L）：NaCl 140；KCl 5.4；HEPES 10，MgCl21，CaCl21，Glucose 10，BaCl21（阻斷內(nèi)向整流K+通道），（pH 7.4 NaOH）。CollagenaseⅡ購(gòu)于Worshington Biochemical公司，EGTA、HEPES、L-谷氨酸、Na2ATP、Na-GTP、Elastase type II-A及Protease均購(gòu)于Sigma公司，其它試劑為化學(xué)分析純。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果以通道電流密度數(shù)值表示，電流密度為電流強(qiáng)度與膜電容的比值（pA/pF），其中電流強(qiáng)度為實(shí)驗(yàn)所測(cè)量電流峰值，膜電容為實(shí)驗(yàn)中記錄到的單個(gè)細(xì)胞電容值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各通道電流密度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件及EXCEL軟件中單因素方差分析（ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的顯著性差異采用SNK法，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠竇房結(jié)HCN通道亞基mRNA表達(dá)

圖1 瓊脂糖凝膠電泳

如表2所示，與對(duì)照組相比，一次力竭組，O-0h組HCN1、HCN4顯著升高（P<0.05，P<0.01），O-4h組HCN1、HCN4也出現(xiàn)顯著升高 （P<0.01，P< 0.05），O-12h組和O-24h組無(wú)顯著變化；反復(fù)力竭組R-0h與R-4h組HCN1 mRNA表達(dá)顯著下降 （P< 0.01，P<0.01），隨著取材時(shí)間的延長(zhǎng)，HCN1呈上長(zhǎng)升趨勢(shì)，R-12h、R-24h組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異；反復(fù)力竭各組HCN2、HCN4 mRNA表達(dá)顯著下降，顯著低于對(duì)照組及一次力竭組（P<0.01），分析數(shù)據(jù)趨勢(shì)可見(jiàn)，隨著運(yùn)動(dòng)結(jié)束后休息及取材時(shí)間的延長(zhǎng)，HCN2與HCN4相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，但仍未恢復(fù)至對(duì)照組水平。

表2 各組大鼠竇房結(jié)HCN通道亞基HCN1、HCN2、HCN4m RNA相對(duì)表達(dá)量（2-△△Ct）

2.2 各組大鼠竇房結(jié)HCN通道電流密度

在電極外液中加入1 mmol/L BaCl2以阻斷內(nèi)向整流K+通道，當(dāng)形成全細(xì)胞封接后，給予細(xì)胞保持電位-40 mV，以10 mV步階，-50 mV～-110 mV、3000 ms的階梯刺激方波，然后復(fù)極至-40mV，記錄到If電流（如圖2）。當(dāng)SAN細(xì)胞經(jīng)由含2mmol/LCsCl的正常臺(tái)式液灌流5 min后，按照同一鉗制方案無(wú)法記錄到內(nèi)向電流，表明這一超級(jí)化激活內(nèi)向電流為If電流。如表3所示，與對(duì)照組相比，一次力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)于大鼠竇房結(jié)HCN通道If電流密度無(wú)明顯影響，反復(fù)力竭各時(shí)相組If電流密度顯著下降（P<0.01）。

表3 各時(shí)相組大鼠竇房結(jié)細(xì)胞HCN通道電流密度（pA/pF）

圖2 對(duì)照組（A）和反復(fù)力竭即刻組（B）大鼠竇房結(jié)If電流原始圖

圖3 對(duì)照組、一次力竭組即刻組和反復(fù)力竭即刻組I-V曲線

3 討論

竇房結(jié)起搏細(xì)胞中，HCN通道是唯一在膜超級(jí)化電位被激活的電壓依賴(lài)性通道，該通道可在復(fù)極化后期接近最大舒張電位時(shí)開(kāi)放。根據(jù)電流學(xué)觀點(diǎn)，HCN通道攜帶的起搏電流If可以啟動(dòng)舒張期去極化的第一部分直至達(dá)到T型和L型Ca2+通道的激活閾電位［13，14］。 Ludwig等［15］在人類(lèi)心臟中發(fā)現(xiàn)兩種起搏通道，If的快成分和慢成分分別是HCN2和HCN4。Stieber等［16］指出，HCN2能夠阻止舒張期膜電位向更負(fù)的方向變化，而HCN4主要維持起搏頻率的穩(wěn)定，并隨著機(jī)體不同的生理狀態(tài)而調(diào)節(jié)頻率。

Ludwig等［17］發(fā)現(xiàn)，小鼠心臟HCN2通道失活可導(dǎo)致竇房結(jié)節(jié)律障礙以及離體竇房結(jié)細(xì)胞中If減小，這提示HCN2基因失活可減慢HCN通道活化速率。然而，HCN2基因敲除小鼠心率并未下降，而表現(xiàn)出間隔很短的竇性心律失常，實(shí)驗(yàn)小鼠其它心臟節(jié)律參數(shù)均正常。該研究小組還觀察到竇房結(jié)細(xì)胞中，由cAMP刺激的最大If電流也未發(fā)生變化。由此可見(jiàn)，HCN2基因敲除小鼠的竇房結(jié)節(jié)律障礙提示，該通道可能在穩(wěn)定心率方面發(fā)揮作用。另有研究發(fā)現(xiàn)［18］，HCN2離子孔道改變不僅抑制HCN2通道電流，而且減少HCN4通道電流，而HCN2變異孔道的過(guò)度表達(dá)會(huì)引起負(fù)性抑制或If“敲除”效應(yīng)，導(dǎo)致初生大鼠心肌細(xì)胞自發(fā)節(jié)律活動(dòng)消失。這進(jìn)一步說(shuō)明HCN通道是重組的，某一通道亞基基因表達(dá)變化會(huì)影響到其它亞基在通道組成中所占的合適比例，進(jìn)而影響亞基所發(fā)揮的功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次力竭運(yùn)動(dòng)未引起HCN2mRNA表達(dá)變化，而反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)則導(dǎo)致大鼠竇房結(jié)HCN2基因表達(dá)下降，長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的HCN2基因下調(diào)并與其它亞基HCN1和HCN4基因表達(dá)下降協(xié)同作用，引起竇房結(jié)起搏細(xì)胞HCN通道的If電流變化，可能誘發(fā)與HCN2基因敲除小鼠類(lèi)似的竇性心律失常發(fā)生。

HCN4作為HCN通道的主要亞基，其編碼的通道參與形成了80%竇房結(jié)細(xì)胞If，這一超級(jí)化激活的電流參與竇房結(jié)細(xì)胞膜舒張期膜電位的自動(dòng)除極。Chandler等［19］應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合原位雜交和免疫熒光染色法對(duì)人竇房結(jié)、右心房組織相關(guān)離子通道m(xù)RNA表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與右心房相比，竇房結(jié)HCN4 mRNA表達(dá)更高。Xiao等［20］采用Realtime PCR技術(shù)檢測(cè)竇房結(jié)和心房組織HCN通道基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)人竇房結(jié)組織HCN4表達(dá)水平高達(dá)75%，可見(jiàn)，HCN4通道在心臟搏動(dòng)的形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，HCN4基因改變與遺傳性竇性心動(dòng)過(guò)緩相關(guān)［21，22］，心臟全部或局部HCN4通道失活可引起小鼠胚胎致命性損害，小鼠胚胎缺失HCN4可導(dǎo)致發(fā)育停止［23，24］，胚胎期HCN4基因缺陷小鼠在胚胎期第10天出現(xiàn)心率緩慢，心臟搏動(dòng)頻率減少了40%；HCN4基因敲除小鼠胚胎在受精后9～12天死亡［25］。此外，HCN4基因缺陷小鼠心臟不能被腎上腺素所激動(dòng)，導(dǎo)致cAMP失去對(duì)心率的調(diào)節(jié)作用。這提示至少在胚胎時(shí)期前11.5天內(nèi)的胚胎心臟中，HCN4通道基因并非形成心臟搏動(dòng)的首要因素，而該通道也是心率自主調(diào)節(jié)所必須的重要因素。HCN4通道亞基在成年期小鼠中的作用與胚胎期不同。如，并未在缺少HCN4的成年小鼠身上觀察到發(fā)育停止或死亡。Herrmann等［25］建立的HCN4基因敲除小鼠（H cn4Cmouse）模型表明，H cn4C成年小鼠發(fā)育正常，但竇房結(jié)細(xì)胞If電流減少80%，并表現(xiàn)出以反復(fù)竇性停搏為特征的心律失常，活動(dòng)時(shí)這一癥狀減少，恢復(fù)基礎(chǔ)心率后，竇性停搏再次出現(xiàn)?？梢?jiàn)，成年H cn4C小鼠以反復(fù)發(fā)生竇性停搏為特征，Hermann等［25］等發(fā)現(xiàn)，H cn4C小鼠竇房結(jié)起搏細(xì)胞超級(jí)化電壓約增加8 mV，且在基礎(chǔ)狀態(tài)下不會(huì)自發(fā)性除極，但這種功能損害可以通過(guò)應(yīng)用腎上腺素刺激彌補(bǔ)。上述研究結(jié)果提示，在成熟的竇房結(jié)細(xì)胞中，HCN4通道可以提供一個(gè)穩(wěn)定的起搏電位，但多數(shù)條件下，尤其是交感神經(jīng)刺激下，HCN4似乎并不能提升起搏活動(dòng)的穩(wěn)定性。然而，隨著復(fù)極電流的增加，例如迷走神經(jīng)興奮或心臟由興奮期過(guò)渡到恢復(fù)期，HCN4通道激活并提供除極電流，從而保持系統(tǒng)的良好平衡。這種“除極儲(chǔ)備”的缺失可以解釋HCN4基因敲除小鼠發(fā)生竇性停搏的機(jī)制。這表明，HCN4是腎上腺素調(diào)節(jié)竇房結(jié)活動(dòng)的重要機(jī)制之一。綜合既往研究可見(jiàn)，HCN4基因表達(dá)變化與竇房結(jié)細(xì)胞HCN通道介導(dǎo)的If電流變化及神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心率的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，兩周力竭游泳運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠竇房結(jié)細(xì)胞HCN4 mRNA表達(dá)明顯下降，提示反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致HCN4基因表達(dá)下調(diào)，可能引起HCN4通道介導(dǎo)的If電流的改變，同時(shí)，離體竇房結(jié)細(xì)胞If電流密度減小，這與既往研究［25］一致。此外，HCN4結(jié)構(gòu)中所包含的cAMP結(jié)合區(qū)域CNBD的缺失和突變與心率的穩(wěn)定及神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心率的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的HCN4基因表達(dá)下調(diào)可能削弱訓(xùn)練比賽中交感神經(jīng)張力增高所誘導(dǎo)的心率增加，而這種竇房結(jié)活動(dòng)的減弱及交感神經(jīng)反應(yīng)性下降可能導(dǎo)致竇性停搏、異位起搏點(diǎn)等惡性心律失常出現(xiàn)，以及心輸出量減少所導(dǎo)致的心、腦、腎等器官無(wú)法滿(mǎn)足機(jī)體運(yùn)動(dòng)需求等猝死危險(xiǎn)因素的增加。

結(jié)合力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)HCN通道亞基HCN1、HCN2、HCN4mRNA表達(dá)影響的研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)HCN通道攜帶的If電流變化進(jìn)行了測(cè)量。結(jié)果表明，兩周反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)明顯降低If電流密度，下降幅度達(dá)37%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，電流密度變化呈上升趨勢(shì)，但在24 h內(nèi)仍明顯低于對(duì)照組?？梢?jiàn)，高強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能導(dǎo)致If電流密度下降，而該通道電流減少可導(dǎo)致竇房結(jié)功能異常。研究發(fā)現(xiàn)，離體竇房結(jié)組織和起搏細(xì)胞中阻斷HCN通道If可減慢起搏活動(dòng)，在體實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似效應(yīng)。If電流對(duì)Cs+的敏感性被用來(lái)推斷If在竇房結(jié)起搏活動(dòng)中的作用，2～5mmol Cs+可顯著減慢起搏速率。Gao等［26］在2009年的研究進(jìn)一步證實(shí)If在竇房結(jié)細(xì)胞起搏活動(dòng)形成及調(diào)節(jié)中的作用。該研究小組對(duì)急性分離的狗竇房結(jié)細(xì)胞使用If阻斷劑ZD7288 3μM后發(fā)現(xiàn)，竇房結(jié)細(xì)胞的自發(fā)活動(dòng)速率下降幅度達(dá)27%并出現(xiàn)不規(guī)律，4期自動(dòng)除極也受到影響。ZD7288還導(dǎo)致最大舒張電位負(fù)向增加3 mV，這一現(xiàn)象說(shuō)明If在穩(wěn)定膜舒張期電位中具有重要作用。舒張期去極化包含兩個(gè)部分，早期的線性部分和后期的非線性部分，綜合既往研究［27，28］發(fā)現(xiàn)，If可能與早期的線性部分有關(guān)。 阻斷If后還可影響β-腎上腺素受體對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位速率的增加效應(yīng)。Gao等［26］使用異丙腎上腺素灌流竇房結(jié)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與未使用阻斷劑組相比，預(yù)先使用ZD7288的細(xì)胞自發(fā)活動(dòng)明顯下降，其它兩種If阻斷劑ivabradine和Cs+也可引起類(lèi)似效應(yīng)?？梢?jiàn)，If在β-腎上腺素加速竇房結(jié)自發(fā)活動(dòng)中具有重要的作用。

力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)細(xì)胞HCN通道影響的原因可能與運(yùn)動(dòng)心臟在神經(jīng)體液因素調(diào)節(jié)下，結(jié)構(gòu)、功能及代謝諸方面的心臟重塑有關(guān)。竇房結(jié)內(nèi)細(xì)胞具有能量代謝低的特點(diǎn)，這是竇房結(jié)在缺血缺氧、代謝抑制等非生理?xiàng)l件下維持心臟正常節(jié)律的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而，長(zhǎng)時(shí)間、高強(qiáng)度的反復(fù)訓(xùn)練仍會(huì)造成竇房結(jié)細(xì)胞和組織的損傷性改變。朱永澤等［29］通過(guò)組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運(yùn)動(dòng)即可造成竇房結(jié)內(nèi)的P細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)生損傷性改變，1周反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)則引起竇房結(jié)細(xì)胞內(nèi)線粒體彌漫性增生、大量凋亡細(xì)胞散在分布、起搏細(xì)胞間連接混亂等超微結(jié)構(gòu)改變。Moffat等［30］研究Langendorff灌流心臟發(fā)現(xiàn)，缺血可引起心率減慢。Gryshenko等［31］應(yīng)用低pH（6.6）“缺血”Tyrode’s模擬缺血條件下的細(xì)胞外酸性環(huán)境，發(fā)現(xiàn)兔竇房結(jié)細(xì)胞的起搏活動(dòng)周期也相應(yīng)改變，如舒張期去極化減慢、動(dòng)作電位幅度減少等，在代謝抑制兔竇房結(jié)細(xì)胞中觀察到If減弱，結(jié)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后的竇房結(jié)組織學(xué)改變可以發(fā)現(xiàn)，反復(fù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致的竇房結(jié)缺血缺氧改變可能是竇房結(jié)細(xì)胞膜上HCN通道亞基及電流發(fā)生改變的原因之一。然而，與之前研究中模型的不同之處在于，兩周力竭游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠竇房結(jié)缺血缺氧的影響程度與直接進(jìn)行“缺血”Tyrode’s液灌流有明顯差異，對(duì)于竇房結(jié)細(xì)胞HCN通道電流的改變也不盡相同，因此，評(píng)估運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中不同強(qiáng)度、類(lèi)型、持續(xù)時(shí)間造成竇房結(jié)組織缺血缺氧的程度及對(duì)HCN通道的影響還需深入探討。此外，多種病理狀態(tài)，如心房纖顫［32，33］、心肌肥厚、心肌梗死或心力衰竭等，均存在竇房結(jié)、心房和心室HCN2、HCN4通道基因的表達(dá)異常，導(dǎo)致心臟不同部位心肌細(xì)胞If電流升高或降低，而這可能與竇房結(jié)起搏活動(dòng)效率下降及異位起搏點(diǎn)的產(chǎn)生有關(guān)，并可誘發(fā)致死性心律失常，這也是運(yùn)動(dòng)猝死的主要原因之一。

綜上，HCN通道介導(dǎo)的If作為“起搏電流”，在竇房結(jié)起搏活動(dòng)的生成和調(diào)節(jié)中具有重要作用，兩周力竭游泳運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致大鼠竇房結(jié)HCN通道主要亞基HCN2和HCN4mRNA表達(dá)下降，以及If電流密度減小，可見(jiàn)，長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)HCN通道結(jié)構(gòu)組成及電生理活動(dòng)的影響可能成為長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)引發(fā)竇房結(jié)功能障礙的主要離子通道機(jī)制之一。

4 總結(jié)

兩周力竭運(yùn)動(dòng)可引起竇房結(jié)HCN通道亞基HCN2及HCN4mRNA表達(dá)下降，If電流密度減小，這可能成為運(yùn)動(dòng)引發(fā)竇房結(jié)功能障礙的離子通道機(jī)制之一。

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Effects of Exhaustive Exercise on the Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide-gated Channels in Sinoatrial Node of Rat

Bo Bing1，2，Chang Yun2
1 Shanghaiuniversity of Sport，Shanghai，China 200438
2 China Institute of Sport Science，Beijing，China 100061

Chang Yun，Email：changyun2518@vip.sina.com

ObjectiveThis paper discusses the subunitmRNA and current density of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels（HCN channel）in sinoatrial node（SAN）at different time phrases after exhaustive exercise.Methods180 healthy adultmale SD rats were equally assigned into following 9 groups：1 control groups（C），4 single bout of exhaustive swimming groups（O），and 4 2-week repeated exhaustive swimming groups（R）.2-hour exhaustive swimming with 3%of body weight on their tails was carried out for groups R，6 days per week for a total of 2 weeks.After 2-week normal feeding，The same exhaustive swimming as for groups R was carried out for the groups O.The sampleswere drawn immediately，and at 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming.ThemRNA expression of HCN channel subunits in SAN in groups R were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR，and the current density of HCN channel by SAN cells isolation and whole-cell patch clamp.Results（1）The HCN1 and HCN4 mRNA expressions in group O immediate（P<0.05，P<0.01），especially 4 hours after swimming（P<0.01，P<0.05）were significantly higher than that in group C，and HCN2 and HCN4 mRNA expressions in groups R immediate and 4 hours after swimming were significantly lower than that in group C（P<0.01，P<0.01）.The HCN2 and HCN4 mRNA expressions in group R 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming decreased significantly（P<0.01）.（2）The current density of HCN channel in group R 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming were significantly lower than that in group C and in group O 4，12，and 24 hours after exhaustive swimming（P<0.01）.ConclusionExhaustive exercise downregulated the SAN HCN2 and HCN4 mRNA expressions，along with the corresponding current If，and induced remolding of HCN channel，which could be one of the most important factors of exercise-induced sinoatrial node dysfunction.

exhaustive swimming，sinoatrial node，hyperpolarization-activated cyclic nucleotidegated，channels

2012.07.10

國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)（10-01）

常蕓，Email：changyun2518@vip.sina.com，Tel：010-87182526