利拉萘酯乳膏的制備與質(zhì)量控制

吳亞利

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海 200031)

利拉萘酯(liranaftate)是由日本Tosoh公司和ZenyakuKogyo公司共同研制開發(fā)的角鯊烯環(huán)氧化酶抑制劑，結(jié)構(gòu)與托萘酯相似，屬于硫代氨基甲酸類抗淺表皮膚真菌感染藥?？拐婢V廣，對包括須發(fā)癬菌在內(nèi)的皮真菌有強(qiáng)大的抗菌活性，藥效比托萘酯大10多倍，對一些致病酵母菌也有很好的活性。該藥毒性小，可口服，不會產(chǎn)生明顯的耐藥性，在用藥過程中不會誘導(dǎo)膽固醇的生物合成[1]。目前國內(nèi)對本品制備的報(bào)道較少。為此，筆者根據(jù)臨床需要研制了利拉萘酯乳膏，用于治療皮膚淺部真菌病，并對此工藝下制備的產(chǎn)品進(jìn)行了質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究。

1 儀器與試驗(yàn)

1100 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);AB204－N型電子天平(瑞士Mettler公司);DT5－6型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);HWS－80型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);Agilent 1100液相色譜儀(配備單元泵，VWD檢測器和杭州英普2000工作站)。利拉萘酯(湖南九典制藥有限公司，批號為110203，含量不低于98.5%);利拉萘酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100791－200501);利拉萘酯乳膏(試制，批號分別為 20111201，20111202，20111203，規(guī)格為 20 mg/10 g);乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方與制備

處方:利拉萘酯20 g，硬脂酸122 g，單硬脂酸甘油酯32 g，白凡士林 9 g，液體石蠟80 g，十八醇45 g，甘油 150 g，三乙醇胺4 g，尼泊金甲酯 0.4g，純化水加至 1 000 g。

制備工藝:取處方量的硬酯酸、單硬脂酸甘油酯、白凡士林、十八醇、液體石蠟置于油相鍋內(nèi)，水浴加熱至85℃，使融化。取處方量的利拉萘酯加入油相鍋內(nèi)，攪拌至完全溶解，水浴保持25 min。另取處方量的甘油、水置于水相鍋內(nèi)，于水浴加熱至60℃。再將三乙醇胺、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯加入水相鍋內(nèi)，攪拌至完全溶解，水浴加熱至85℃。先將油相置于乳化鍋內(nèi)，恒溫下將水相緩緩加入，迅速攪拌。攪拌至室溫，測定軟膏的含量。灌裝于10克規(guī)格的軟管中，裝量為10 g/支。

2.2 一般質(zhì)量控制

性狀:本品為白色乳膏。

鑒別:采用色譜法鑒別。取本品適量(約相當(dāng)于利拉萘酯5 mg)，精密稱定，置10 mL量瓶中，加流動相適量，超聲15 min，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取60℃真空干燥至恒重的對照品適量，用流動相溶解并稀釋，制成每1 mL含100 μg的對照溶液。照有關(guān)物質(zhì)測定項(xiàng)下的色譜條件檢查，分別取20 μL進(jìn)樣，供試品溶液色譜中主峰的保留時(shí)間與對照品溶液色譜主峰的保留時(shí)間一致。

粒度:取適量的供試品，涂成薄層，薄層面積相當(dāng)于蓋玻片面積，共涂3片，照[2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅨE]第一法，在50～100倍顯微鏡(型號LEICA S91410)下檢視，樣品的粒度均小于 180 μm，符合規(guī)定。

裝量:取本品5支，照[2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅩF]項(xiàng)下方法檢查。結(jié)果見表1。本品的標(biāo)示裝量為10.0 g(＜20 g)，[2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅩF]項(xiàng)下規(guī)定，軟膏平均裝量不少于標(biāo)示裝量的93%。測定了3批軟膏的裝量，符合規(guī)定。

2.3 有關(guān)物質(zhì)檢測

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

照高效液相色譜法[2010年版《中國藥典(二部)》附錄ⅤD]試驗(yàn)。色譜柱為 Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為磷酸鹽緩沖溶液(取磷酸二氫鉀2.7g，加水1000 mL溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)－乙腈(20∶80)，檢測波長為281 nm，流速1.0 mL/min，柱溫室溫。理論板數(shù)按利拉萘酯峰計(jì)算應(yīng)不低2 500。利拉萘酯與相鄰峰的分離度符合規(guī)定。

表1 3批利拉萘酯乳膏裝量檢查結(jié)果(g)

2.3.2 溶液制備

取空白軟膏約0.25 g，置10 mL量瓶中，加流動相適量，超聲15 min，再加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。精密稱取本品原料藥50 mg，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋，制成每1 mL含100 μg的溶液，作為對照溶液。精密稱取本品軟膏適量(約相當(dāng)于利拉萘酯5 mg)，置10 mL量瓶中，加流動相適量，超聲15 min，再加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別取上述溶液各20 μL，按擬定色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在利拉萘酯主峰和主要雜質(zhì)的出峰位置，空白輔料無信號，不干擾含量測定和有關(guān)物質(zhì)的檢查。

破壞性試驗(yàn):取本品適量(約相當(dāng)于利拉萘酯5 mg)，分置10 mL試管中。于強(qiáng)酸(1 mol/L鹽酸溶液2 mL)、強(qiáng)堿(1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL)、加熱(沸水浴1 h)、光照(紫外光照射24 h)及氧化(30%雙氧水2 mL)等惡劣條件下，對試驗(yàn)樣品進(jìn)行加速破壞。酸、堿破壞的樣品分別用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性后，再分別加流動相至10 mL，超聲15min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。氧化、光照及加熱破壞的樣品加流動相10 mL，超聲15 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取未經(jīng)破壞的軟膏色譜圖，作為對照色譜圖。照擬訂色譜條件試驗(yàn)，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，見圖1。由試驗(yàn)可知，本品在紫外光照、強(qiáng)酸條件破壞不明顯，而在堿、熱、氧化條件下均有破壞，各破壞產(chǎn)物峰與主峰能完全分離，擬訂的色譜條件可用于本品有關(guān)物質(zhì)檢查。

定量限和最小檢測限:取利拉萘酯對照品10.21 mg，用流動相逐步稀釋，依法依法進(jìn)樣20 μL，記錄色譜，至利拉萘酯主峰峰高約為噪音的3倍時(shí)，計(jì)算出最低檢出限為2.6 ng。至利拉萘酯主峰峰高約為噪音的10倍時(shí)，計(jì)算出定量限為7.6 ng。

2.3.4 樣品有關(guān)物質(zhì)檢查

稱取本品約15 g，加流動相溶解并稀釋至50 mL，濾過，取濾液5 mL用流動相稀釋至50 mL，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，加流動相稀釋至100 mL，作為對照溶液。照2.3.1項(xiàng)下方法，取對照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～25%，再取供試品溶液和自身對照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜至主峰保留時(shí)間的2倍，分別計(jì)算最大單一雜質(zhì)峰含量及各雜質(zhì)峰總和的含量。3批樣品中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，本品3批樣品總有關(guān)物質(zhì)均小于1.0%，單個(gè)最大雜質(zhì)均小于0.5%。

圖1 利拉萘酯乳膏高效液相色譜圖

表2 3批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果(%)

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

由于本品輔料多，且有關(guān)物質(zhì)采用液相法測定，擬采用有關(guān)物質(zhì)測定色譜條件進(jìn)行含量測定方法學(xué)驗(yàn)證。

2.4.2 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取利拉萘酯對照品9.63 mg，置25 mL容量瓶中，加流動相使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取該溶液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，各取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜，以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 C=4.45×10－7A －0.297(r=0.999 8)。結(jié)果表明，利拉萘酯質(zhì)量濃度在38.52～192.6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)鍵良好。

精密度試驗(yàn):取質(zhì)量濃度為115.56 μg/mL的利拉萘酯對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按擬訂的色譜條件測定。結(jié)果峰面積的RSD=0.68%(n=6)，表明方法精密度良好。

加樣回收試驗(yàn):取60℃真空干燥至恒重的利拉萘酯對照品和空白軟膏適量，精密稱定，照軟膏規(guī)格(利拉萘酯20 mg/g)按80%，100%和120%的比例配制成模擬軟膏，各分別稱取3份。置10 mL量瓶中，加適量流動相，超聲15 min，再加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2.0 mL至10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取60℃真空干燥至恒重的利拉萘酯對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每1 mL含100 μg的對照溶液。取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按含量測定項(xiàng)下方法測定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 樣品含量測定

精密稱取本品適量(約相當(dāng)于利拉萘酯5 mg)，置10 mL量瓶中，加流動相，超聲15 min，再加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度。另取60℃真空干燥至恒重的利拉萘酯對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋成每1 mL中約含100 μg的溶液，作為對照品溶液。分別取對照品溶液與供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取利拉萘酯峰的峰面積。用外標(biāo)法計(jì)算利拉萘酯的含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，3批軟膏中利拉萘酯含量范圍為 99.81% ～103.09%;RSD均小于 2.0%，說明用本法測定軟膏中利拉萘酯含量，其方法精密度能夠滿足定量要求，可以作為含量測定的方法。

表4 樣品含量測定結(jié)果

2.5 皮膚刺激試驗(yàn)[2]

采用人體貼敷法，分別在手臂、面部及背部皮膚上涂搽，并取另側(cè)皮膚相對位置進(jìn)行乳膏基質(zhì)對照試驗(yàn)，涂樣量均為1 g，24 h后觀察。結(jié)果兩側(cè)皮膚均未發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)，且無刺激感。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)[3]

離心試驗(yàn):取樣品10 g，置玻璃離心管中，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，結(jié)果乳膏未見分層現(xiàn)象。

耐熱、耐寒試驗(yàn):取本品10 g，裝于密閉小瓶中，分別置55℃恒溫水浴箱中恒溫6 h、置冰箱(－12℃)中放置24 h。結(jié)果乳膏均未見分層現(xiàn)象。

影響因素試驗(yàn):取一批樣品，試驗(yàn)前全部除去包裝，將乳膏置玻璃平皿中，暴露于強(qiáng)光(4 500 lx)、高溫(40℃)、低溫(4℃)、高濕(RH 92.5%)的環(huán)境下試驗(yàn)，分別于第5，10天取樣供檢測，與0天作比較。結(jié)果見表5?？芍刘ボ浉嘣诠庹?、高溫、低溫及高濕等試驗(yàn)環(huán)境中均穩(wěn)定，含量均無明顯改變，HPLC法檢查未發(fā)現(xiàn)新的雜質(zhì)峰，利拉萘酯的峰面積比也未下降;除在高濕條件下體積略有增大和高溫條件下除體積略有減小外(由于完全暴露在試驗(yàn)環(huán)境中，此變化為吸水或失水過程，屬物理改變)，其余均無明顯改變。提示本品應(yīng)置陰涼干燥處保存。

表5 樣品穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)結(jié)果(批號20111201)

3 討論

參考日本Torii公司上市制劑Zefnart?[4]，每g含20 mg利拉萘酯的規(guī)格，制訂本品每g含利拉萘酯2%?？紤]到本品為治療真菌感染的外用制劑，故將本品制成O/W型軟膏，使基質(zhì)中藥物的釋放和穿透皮膚較其他類型基質(zhì)快，且無油膩性、易用水洗除。

在選擇液相色譜條件時(shí)，由于輔料多，且極性差異大，流動相不同，可能導(dǎo)致輔料等干擾主成分的測定。經(jīng)過試驗(yàn)，最終選擇以磷酸鹽緩沖溶液(取磷酸二氫鉀2.7 g，加水1 000 mL溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)－乙腈(20∶80)為流動相時(shí)，利拉萘酯能在較合適的時(shí)間出峰，而且能消除輔料對測定的干擾;乙腈對乳膏樣品中的利拉萘酯溶解性較好，采用流動相直接稀釋樣品，操作簡便。本法準(zhǔn)確度和精密度高，穩(wěn)定性好，可用于控制利拉萘酯乳膏的含量。

[1]鐘 倩.角鯊烯環(huán)氧化酶抑制劑抗真菌藥利拉萘酯[J].國外醫(yī)藥:合成藥、生化藥、制劑分冊，2001，22(3):190.

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[4]日本病院藥劑師會醫(yī).藥品インタビュ一フォ一ム[EB/OL].日本:日本病院藥劑師會醫(yī)，2010[20120315].http://www.shijieyaofang.com/upload/product/2011112121260426.PDF