LC-MS/MS 同時測定卷煙主流煙氣中4 種芳香胺

余晶晶，王，謝復(fù)煒，陳玉松，趙 閣，張曉兵

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

芳香胺類化合物在煙葉和煙氣中均有分布，但煙氣中的含量略高。1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯4種芳香胺被列入Hoffmann名單中［1］，且被國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）列為致癌物［2］。目前，芳香胺化合物的檢測方法主要有氣相色譜法［3-4］、液相色譜法［5-7］、毛細管電泳法［8］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）［9-11］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）［12-15］等。GC/MS是分析卷煙主流煙氣中主要芳香胺類化合物最常用的手段，相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23358—2009《卷煙 主流煙氣總粒相物中主要芳香胺的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》已發(fā)布實施。然而，由于煙氣樣品的基質(zhì)十分復(fù)雜，4種芳香胺化合物含量極低（ng/支），采用GC/MS測定時，樣品前處理需要多步液液萃取、濃縮操作，且需要衍生化反應(yīng)，1次樣品前處理約需2 d。LC-MS/MS因具有靈敏度高、選擇性好等特點，特別適用于復(fù)雜基質(zhì)中超低含量物質(zhì)的定量分析，已用于不同基質(zhì)中芳香胺的測定。Saha等［12］采用LC-MS/MS測定了卷煙主流煙氣中的6種芳香胺，但其樣品前處理采用液液萃取方式，操作繁瑣費時，且未測定4-氨基聯(lián)苯。因此，采用陽離子交換固相萃取柱對樣品進行純化處理，建立同時測定卷煙主流煙氣中4種芳香胺的LC-MS/MS方法，可為卷煙煙氣中有害成分分析及卷煙安全性評價提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

20種市售卷煙樣品。其中1～15為國產(chǎn)烤煙型卷煙，16～18為國產(chǎn)混合型卷煙，19為進口烤煙型卷煙，20為進口混合型卷煙。其盒標(biāo)煙氣焦油、煙堿和CO量如表1所示。

1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯、d7-1-氨基萘、d9-4-氨基聯(lián)苯（純度≥98%，上海安譜公司）；甲醇（色譜純，美國J&T Baker公司）；乙腈（色譜純，美國Dikma公司）；甲酸（色譜純，美國Tedia公司）；甲酸銨（色譜純，美國Alfa Aesar公司）；氨水（AR，美國CNW公司）；鹽酸（AR，洛陽市化學(xué)試劑廠）。

API5500質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SM450直線式吸煙機（英國Cerulean公司）；Milli-Q50超純水儀（美國Millipore公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP2245電子天平（感量：0.0001 g，德國Sartorius公司）；Dikma ProElut PXC固相萃取柱（150 mg/6 mL，美國Dikma公司）；Agilent Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國Agilent公司）；Waters Oasis?MCX固相萃取柱（150 mg/6 mL，美國Waters公司）。

1.2 樣品處理與分析

將卷煙樣品放置于（22±1）℃，相對濕度為（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h，然后挑選（平均質(zhì)量±0.02）g和（平均吸阻 ±49）Pa/支的煙支作為測試煙支。采用直線式吸煙機按照ISO標(biāo)準(zhǔn)條件抽吸卷煙，即每60 s抽吸一口，每口抽吸容量35 mL，抽吸持續(xù)時間2 s。用?44 mm劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣總粒相物，每張濾片收集4支或5支卷煙的總粒相物，取收集20支卷煙煙氣總粒相物的濾片置于200 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入100 mL 5%（質(zhì)量分數(shù)）HCl和100μL氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（d7-1-氨基萘和d9-4-氨基聯(lián)苯濃度分別為2μg/mL 和 0.4μg/mL），超聲萃取30 min，然后用移液管準(zhǔn)確移取50 mL萃取液，上樣到Dikma ProElut PXC陽離子交換固相萃取柱［使用前用10 mL甲醇和10 mL 5%（體積分數(shù)）HCl活化］，依次用10 mL水和10 mL甲醇洗滌，最后用5 mL 5%（體積分數(shù)）氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液混勻后取樣進行LC-MS/MS分析。分析條件為：

色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP18（150 mm × 2.1 mm i.d.，3.5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：A：0.1%（體積分數(shù)）甲酸溶液（V/V），B：0.1%（體積分數(shù)）甲酸乙腈溶液；洗脫方式：75%A+25%B，等度洗脫；流速：200 μL/min；分析時間：15 min，進樣體積10 μL。離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓：4500 V；氣簾氣壓力：206.8 kPa（30 psi）；輔助氣 1壓力：482.6 kPa（70 psi）；輔助氣 2壓力：482.6 kPa（70 psi）；離子源溫度：500℃；化合物的定量離子對、定性離子對、駐留時間、碰撞能量（CE）及去簇電壓（DP）見表2。

表2 各芳香胺的MRM參數(shù)①

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

芳香胺同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)、性質(zhì)極為相似，液相色譜分離困難。為實現(xiàn)1-氨基萘、2-氨基萘及3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯的液相色譜分離，考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm i.d.，2.7 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（50 mm × 2.1 mm i.d.，1.8 μm）、Waters Symmetry ShieldTMRP18（150 mm × 2.1 mm i.d.，3.5 μm）等色譜柱對4種芳香胺的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Waters Symmetry ShieldTMRP18柱能實現(xiàn)4種芳香胺的同時分離，如圖1所示。由圖2可知，主流煙氣樣品中4種芳香胺峰型較好，與干擾物能較好分離，可以滿足定性、定量分析要求。

圖1 4種芳香胺標(biāo)樣的MRM圖

圖2 卷煙主流煙氣樣品中4種芳香胺的MRM圖

對流動相組成及梯度條件進行了優(yōu)化。研究表明，流動相組成為75%A（0.1%甲酸溶液）+25%B（0.1%甲酸乙腈溶液），等度洗脫時，兩組芳香胺同分異構(gòu)體可實現(xiàn)基線分離，且出峰完全僅需9 min。流動相中加入一定比例的甲酸有助于芳香胺的離子化，提高質(zhì)譜響應(yīng)。此外，考察了色譜柱柱溫對4種芳香胺質(zhì)譜響應(yīng)的影響，當(dāng)柱溫為20，30，40℃時，質(zhì)譜響應(yīng)無顯著差異；當(dāng)柱溫為50℃時，質(zhì)譜響應(yīng)降低，噪聲增大。因此，選擇柱溫為30℃。

2.2 煙氣捕集條件的選擇

采用劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣中的總粒相物；采用2個裝有50 mL 5%HCl溶液的吸收瓶串聯(lián)捕集氣相物。分別采用固相萃取柱凈化處理后進LC-MS/MS分析，結(jié)果表明，兩個吸收瓶溶液中均未檢出4種芳香胺，可見主流煙氣中的4種芳香胺主要分布在總粒相物中。因此，用劍橋濾片捕集主流煙氣中的4種芳香胺。

2.3 劍橋濾片萃取條件的優(yōu)化

采用5%HCl溶液萃取劍橋濾片，考察了超聲和振蕩萃取2種不同的方式。研究發(fā)現(xiàn)，采用振蕩萃取時，劍橋濾片容易破碎，在固相萃取過程中，濾片碎末容易堵塞上樣管。另外，振蕩萃取30 min與超聲萃取30 min所測得的4種芳香胺含量接近。因此，實驗中選擇超聲萃取。同時，考察了超聲萃取時間的影響，30 min最佳。

2.4 固相萃取條件的確定

芳香胺類化合物為堿性化合物，陽離子交換固相萃取柱對堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度，適合復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的除雜和純化。實驗考察了Dikma ProElut PXC，Agilent Bond Elut Plexa PCX和 Waters Oasis?MCX 3種不同廠家生產(chǎn)的陽離子交換固相萃取柱，實驗結(jié)果表明，采用不同固相萃取柱所測得的結(jié)果無明顯差異。由于采用Dikma固相萃取柱處理時所需時間最短，故實驗中選其進行樣品前處理。

煙氣樣品十分復(fù)雜，基質(zhì)干擾往往會掩蓋低濃度目標(biāo)物的信息。在5%HCl溶液中加入一定量的標(biāo)樣作為模擬樣品，以更準(zhǔn)確地反映目標(biāo)分析物在固相萃取過程中的保留及洗脫情況。首先考察固相萃取過程中目標(biāo)物的保留情況，分別收集上樣、淋洗和洗脫等步驟的流出液，LC-MS/MS分析結(jié)果表明，流出液中均未檢出這4種芳香胺，由此可知在上樣和凈化過程中4種芳香胺幾乎都保留在固相萃取小柱上。為將固相萃取柱上保留的目標(biāo)分析物完全洗脫下來，考察了洗脫液組成的影響。圖3為不同組成的洗脫液洗脫固相萃取柱時，目標(biāo)分析物被洗脫的比例，由圖3可知，采用5%氨水+95%甲醇溶液才能將目標(biāo)分析物完全洗脫。因此，選擇含5%氨水的甲醇作為洗脫溶液。同時，考察了洗脫液體積的影響，同樣采用模擬樣品進行實驗。增大洗脫體積能夠保證把目標(biāo)物盡可能全部洗脫出來，但目標(biāo)物的濃度也會隨著體積增大而降低。實驗中分別采用5，10，15，20，25 mL洗脫液進行洗脫。圖4為采用不同體積洗脫液洗脫后，4種芳香胺與其相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)面積比（A/As）。由圖4可知，采用5 mL洗脫液洗脫時，即能將待測目標(biāo)物完全洗脫。因此，選擇5 mL洗脫液進行洗脫。

圖3 洗脫液組成對芳香胺凈化效果的影響

圖4 洗脫液體積對芳香胺凈化效果的的影響

2.5 工作曲線與檢測限

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制。準(zhǔn)確稱取100 mg 1-氨基萘、50 mg 2-氨基萘、20 mg 3-氨基聯(lián)苯和10 mg 4-氨基聯(lián)苯，分別置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，則1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度分別為1.0，0.5，0.2和0.1 mg/mL。該標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于-18℃下避光保存，有效期為3個月。一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別移取1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯的標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，4種芳香胺的濃度分別為10.0，5.0，2.0和1.0 μg/mL。二級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：移取10.0 mL一級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，4種芳香胺的濃度分別為1.0，0.5，0.2和0.1 μg/mL。

內(nèi)標(biāo)儲備液配制。準(zhǔn)確稱取100 mg d7-1-氨基萘和20 mg d9-4-氨基聯(lián)苯，分別置于不同的100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為1.0和0.2 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。該內(nèi)標(biāo)儲備溶液于-18℃下避光保存，有效期為3個月。一級混合內(nèi)標(biāo)溶液配制：分別移取d7-1-氨基萘、d9-4-氨基聯(lián)苯儲備液1.0 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，濃度分別為10.0和2.0 μg/mL。二級混合內(nèi)標(biāo)溶液配制：移取10.0 mL一級混合內(nèi)標(biāo)溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，濃度分別為2.0和0.4 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制。分別移取0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10 mL二級混合標(biāo)準(zhǔn)溶液置于不同的100 mL容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入1.0 mL二級混合內(nèi)標(biāo)溶液，用5%氨水甲醇溶液定容，即得表3所示的7級標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，d7-1-氨基萘和d9-4-氨基聯(lián)苯濃度分別為20.0和4.0 ng/mL。

分別對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行LC-MS/MS分析，并以芳香胺與內(nèi)標(biāo)物峰面積比（Y）對其濃度比（X）進行線性回歸，得到各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見表4。其中，1-氨基萘、2-氨基萘內(nèi)標(biāo)為d7-1-氨基萘；3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯內(nèi)標(biāo)為d9-4-氨基聯(lián)苯。

表3 4種芳香胺的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 （ng/mL）

表4 4種芳香胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限及定量限

取最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行測定10次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢測限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限，結(jié)果如表4所示。1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯的檢測限分別相當(dāng)于0.019，0.018，0.012和0.008 ng/支，定量限分別相當(dāng)于0.065，0.060，0.039和0.027 ng/支。

2.6 回收率與精密度

取烤煙型和混合型卷煙樣品各1種，平行測定3次，并在高、中、低3個水平上進行加標(biāo)回收率測定，結(jié)果（表5）表明，方法的加標(biāo)回收率范圍分別在72.1%～104.6%，70.5%～104.5%，83.1%～104.4%和86.6%～116.5%之間。4種芳香胺的日內(nèi)精密度＜6%，日間精密度＜9%，可知日內(nèi)及日間精密度較好。為考察樣品的穩(wěn)定性，將前處理后的樣品密閉于2 mL色譜樣品瓶中，同一天連續(xù)進樣5次，4種芳香胺變異系數(shù)分別為1.34%，2.05%，1.89%和4.06%。分別在前處理當(dāng)天和第3，5，7 d進樣分析，4種芳香胺變異系數(shù)分別為3.22%，8.12%，5.45%和9.09%，表明4種芳香胺在一周內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 4種芳香胺的加標(biāo)回收率、日內(nèi)及日間精密度

2.7 樣品分析及與GC/MS測定結(jié)果比較

選擇國內(nèi)外不同焦油量的烤煙及混合型卷煙20種，采用本方法及GB/T 23358—2009中的GC/MS方法分別對卷煙樣品主流煙氣中的4種芳香胺進行測定，結(jié)果如表6所示。采用本方法所測得20種卷煙主流煙氣中1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯、4-氨基聯(lián)苯的含量 范 圍 分 別 為 5.18～20.88，2.17～7.78，0.66～1.92，0.39～1.46 ng/支，平均值分別為 11.80，3.87，1.05，0.75 ng/支。與GC/MS測定結(jié)果進行比較，以本方法結(jié)果對GC/MS結(jié)果作線性回歸曲線，1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯及4-氨基聯(lián)苯的線性相關(guān)系數(shù)R分別為0.91，0.77，0.86和0.87。可見，兩種分析方法的結(jié)果相關(guān)性較好。

表6 采用本方法與GC/MS測定的20種卷煙主流煙氣中4種芳香胺的含量 （ng/支）

3 結(jié)論

建立了檢測卷煙主流煙氣中4種主要芳香胺的LC-MS/MS方法。本方法采用Dikma ProElut PXC陽離子交換固相萃取柱凈化樣品，省去了衍生化操作，整個樣品前處理過程不超過1.5 h；通過對液相色譜條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基聯(lián)苯和4-氨基聯(lián)苯兩組同分異構(gòu)體的同時檢測。采用本方法及GC/MS對國內(nèi)外20種不同焦油量卷煙樣品進行了分析比較，兩種方法的測定結(jié)果相關(guān)性良好。本方法適合于卷煙主流煙氣中4種芳香胺的快速、靈敏測定。

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