復方甘草酸苷對大鼠急性肝衰竭保護機制的研究

裴旭東，翟玉峰，張懷宏

復方甘草酸苷對大鼠急性肝衰竭保護機制的研究

裴旭東，翟玉峰，張懷宏

目的 探討甘草酸苷對大鼠急性肝衰竭(AHF)的保護機制。方法 將90只Wistar大鼠隨機分為3組:正常對照組(對照組)、模型組(AHF組)、治療組(甘草酸苷組)，靜脈注射硫代乙酰胺(TAA)600 mg/kg，2次，每次間隔24 h，復制AHF動物模型。治療組動物除予TAA外，于實驗前3 d至實驗結(jié)束分別靜滴甘草酸苷注射液2 mL/100 g，對照組和AHF組同時皮下注射0.9%氯化鈉液1 mL/100 g。AHF組、治療組于第2次注射TAA后24 h，隨機各取8只，治療中分時段取大鼠腹主動脈血檢測肝功能、PTA、血清內(nèi)毒素及多種炎性因子水平。2周后，取肝組織，用10%甲醛液固定，檢測肝細胞增殖細胞核抗原陽性率(PCNA)。結(jié)果 與AHF組、對照組相比，治療中，治療組血清ALT水平降低(P＜0.01);治療2周后，治療組血清總膽紅素水平(同比例)降低，而血漿凝血酶原活動度(PTA)均值較高(P＜0.01);治療后各時相點，治療組TNF-α水平較低(P＜0.01);治療2周后，治療組患者血漿內(nèi)毒素及IL-6水平顯著降低(P＜0.01)。治療2周后，治療組PCNA陽性細胞表達顯著高于對照組(P＜0.01)。結(jié)論 甘草酸苷對急性肝衰竭大鼠模型具有保護作用，其機制可能與降低血漿內(nèi)毒素及細胞因子水平、促進肝組織PCNA表達有關(guān)。

急性肝衰竭;內(nèi)毒素;細胞因子;增殖細胞核抗原;甘草酸苷

Key words:Acute hepatic failure;Endotoxin;Cytokine;Proliferation cell nuclear antigen;Compound glycyrrhizin

急性肝衰竭(AHF)表現(xiàn)為肝細胞廣泛壞死和肝功能嚴重障礙，臨床上死亡率極高，目前尚無有效的治療方法。其病理與細胞免疫導致的炎性壞死有關(guān)，其中以腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為核心的細胞因子網(wǎng)絡(luò)在肝細胞壞死或凋亡中具有重要作用［1-2］。有研究顯示，復方甘草酸苷(Compound glycyrrhizin，CG)能有效降低暴發(fā)性肝衰竭大鼠模型血漿TNF-α、NO、內(nèi)皮素(ET)、白細胞介素-6 (IL-6)水平，對肝損傷產(chǎn)生保護作用［3］。本文建立大鼠AHF模型，深入探討兩者聯(lián)合使用對AHF細胞再生作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量180～230 g，雌雄各半，購自武漢大學醫(yī)學動物中心。硫代乙酰胺(TAA)，北京中杉生物科技有限公司生產(chǎn)。PCNA試劑盒，購自武漢博士德公司。SNMC注射液為復方甘草酸苷(美能)日本米諾發(fā)源制藥株式會社生產(chǎn)提供。促肝細胞生長素(HGPF)，購自威海賽洛金藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法 90只大鼠隨機分為3組:正常對照組(對照組)12只，模型組(AHF組)12只，治療組12只。實驗開始，AHF組、治療組采用皮下注射(sc.)TAA 600 mg/kg，2次，間隔24 h，復制AHF動物模型。治療組除給予TAA外，于實驗前3 d至實驗結(jié)束給予 CG注射液 1 mL/100 g (sc.)，AHF組同時予0.85%氯化鈉注射液1 mL/ 100 g(sc.)。AHF組、治療組于第2次注射TAA后24 h，隨機取大鼠各8只，麻醉后腹主動脈取血測肝功能。隨后迅速取肝左中葉組織，用10%甲醛液固定，石蠟切片，備檢。其余大鼠用于2周病死率觀察。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 肝功能 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBiL)及血漿凝血酶原活動度(PTA)水平，全自動生化分析儀測定。

1.3.2 血漿內(nèi)毒素檢測采用鱟試驗(試劑為武漢博士德科技有限公司產(chǎn)品)，TNF-α和IL-6檢測采用ELISA法(試劑為上海羅氏生物制藥有限公司產(chǎn)品)。

1.3.3 肝細胞增殖細胞核抗原(PCNA) 石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加10%正常羊血清封閉，順序加一抗、二抗、三抗，繼之以PBS沖洗，以聯(lián)苯二氧胺(DBA)顯色，甲基綠復染。胞核顯示棕褐色為PCNA陽性。PCNA標記指數(shù)以隨機選擇高倍視野中至少500個細胞，以計數(shù)PCNA陽性核百分數(shù)表示(陽性核數(shù)目/計數(shù)的肝細胞總數(shù)×100%)。

2 結(jié)果

2.1 各組病死率比較 AHF組、對照組、治療組2周病死率分別為68.2%(7/12)、16.7%(2/12)、25.0%(3/12)，治療組與 AHF組比較，P＜0.01);與對照組比較，P＞0.05。

2.2 各組肝功能情況比較 見表1。由表1可見，治療前，三組患者血清ALT、TBiL及PTA比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);治療后，治療組各時相點治療組血清ALT水平顯著低于AHF組(P＜0.01);對照組各時相點治療組血清ALT水平低于AHF組(P＜0.05);治療2周后，治療組血清TBIL水平顯著低于AHF組，PTA均值明顯高于AHF組(P＜0.01);而對照組血清TBIL水平低于AHF組(P＜0.01)，PTA均值高于AHF組(P＜0.05);

表1 各組肝功能情況比較

2.3 各組患者血漿內(nèi)毒素水平及細胞因子水平的變化 見表2。治療前，三組患者血漿內(nèi)毒素及細胞因子水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);治療后1、2周后，治療組患者血漿內(nèi)毒素、IL-6水平顯著低于AHF組、對照組(P＜0.01);治療后各時相點，治療組TNF-α水平低于AHF組、AHF組及對照組(P＜0.01)。

表2 各組患者血漿內(nèi)毒素水平及細胞因子水平的變化

2.4 各組治療后各時相PCNA陽性細胞表達率檢測比較 見表3。治療后第1周，PCNA陽性細胞表達率明顯高于AHF組(P＜0.01);治療第2周，PCNA陽性細胞表達率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表3 各組PCNA檢測比較(%)

3 討論

PCNA(周期蛋白，cyclin)，直接參與細胞增殖的DNA復制，其表達增高可促進細胞DNA合成增加［4］，起調(diào)節(jié)DNA多聚酶δ活性的作用。因此，檢測PCNA在細胞中的表達，可評價細胞的增殖狀態(tài)［5］，是評價肝臟再生的一個良好指標。PCNA在正常肝細胞中表達的陽性率很低，隨著肝細胞增生活躍，尤其是肝切除后，陽性率逐漸增加，說明細胞的增殖能力逐漸增強。Wolf采用PCNA與5-溴脫氧尿核苷檢測DNA合成，發(fā)現(xiàn)與肝臟再生有正相關(guān)性［2］。

甘草酸苷(CG)主要活性成分β體甘草酸為2分子萄萄糖醛酸和苷元-甘草次酸的聚合物，在體內(nèi)經(jīng)β-葡糖醛酸苷酶將二者分解。甘草次酸在化學結(jié)構(gòu)上類似腎上腺皮質(zhì)激素，而后者在肝內(nèi)代謝失活起競爭性抑制作用，間接提高了體內(nèi)皮質(zhì)激素的水平。本研究表明，甘草酸苷可從多個環(huán)節(jié)對AHF產(chǎn)生保護作用:①抗炎保肝作用，能促進肝細胞修復［6-7］;②抑制TNF-α、IL-6等細胞因子的產(chǎn)生，減輕內(nèi)毒素介導的繼發(fā)性肝細胞損傷;③促進重型肝炎患者血漿內(nèi)毒素的清除;④降低膽紅素及透明質(zhì)酸含量，有促進氧化磷酸化、活躍肝細胞生物氧化功能和蛋白質(zhì)合成作用，阻斷AHF病變的發(fā)展。日本學者已證實，CG具有抗小鼠FLF細胞凋亡作用［1］，對AHF大鼠肝細胞有保護機制。本研究表明，CG不僅具有護肝、降酶、退黃作用，而且可以減少AHF的肝細胞凋亡，使AHF中變性的肝細胞恢復，使未受到損傷的肝細胞得到保護，促進肝細胞的再生，從而使AHF的肝細胞壞死面積縮小，降低大鼠的病死率［8］。

綜上所述，CG可以清除內(nèi)毒素，降低炎性介質(zhì)水平，促進PCNA表達水平，減少肝細胞凋亡，從而促進肝細胞的再生，從而使AHF的肝細胞壞死面積縮小，降低病死率。但CG治療AHF的劑量和治療時機尚無明確定論，本實驗所用小劑量相當于臨床上應(yīng)用的一般劑量。至于大劑量是否有毒副作用還有待于進一步探討。

［1］ Hidaka I，Hino K，Korenaga M，et al.Stronger Neo-Minophagen C，aglycyrrhizin-containing preparation，protects liver against carbon tetrachloride-induced oxidative stress in transgenic mice expressing the hepatitisC virus polyprotein［J］.Liver Int，2007，27(6):845-853.

［2］ Thakur V，McMullen MR，Pritchard MT，et al.Regulation of macrophage activation in alcoholic liver disease［J］.J Gastroenterol Hepatol，2007，22(Suppl 1):S53-S56.

［3］ Hatano E.Tumor necrosis factor signaling in hepatocyte apoptosis［J］.J Gastroenterol Hepatol，2007，22(Suppl 1):S43-S44.

［4］ Maga G，Hübscher U.Proliferating cell nuclear antigen(PCNA):a dancer with many partners［J］.J Cell Sci，2009，116 (15):3051-3060.

［5］ Toueille M，Saint Jean B，Castroviejo M，et al.The elongation factor 1A:A novel regulator in the DNA replication/repair protein network in wheat cells［J］.Plant Phusiol Biochem，2007，45:113-118.

［6］ 郭蓮怡，聞穎，劉沛.復方甘草酸苷對酒精性肝炎患者血清TNF-α、IL-8及 LPO的影響［J］.中國醫(yī)師雜志，2007，9 (3):353-354.

［7］ 張平，姚履楓，張月英.復方甘草酸苷與干擾素a-2b聯(lián)合治療慢性乙型肝炎的臨床觀察［J］.中國醫(yī)藥，2010，5(10): 896-897.

［8］ Stickel F，Schuppan D.Herbal medicine in the treatment of liver diseases［J］.Dig Liver Dis，2007，39(4):293-304.

Efficacy of protective mechanism of compound glycyrrhizin on acute hepatic fail-urein rats

PEI Xu-dong，ZHAI Yu-feng，ZHANG Huai-hong(Henan Province Nanyang Urban Central Hospital，Nanyang 473009，China)

Objective To study the protective mechanism of compound glycyrrhizin(CG)on acute hepatic failure(AHF)in rats.Methods 90 rats were randomly divided into normal group，model group and treatment group (compound glycyrrhizin).Thioacetamide(TAA)600 mg/kg was given(iv.)once daily for 2 times，and model of AHF was made.Treatment group was given CG 2 mL/100 g(iv.)at 3 d before and after treatment besides TAA，while control group and AHF group were given NS 1 mL/100 g(ih.).The ALT，TBIL，PTA，endotoxin and many kinds of inflammatory factor level were measured.The hepatic tissue was taken and fixed into 10%formalin after 2 weeks，and the masccline rate of proliferation cell nuclear antigen was detected.Results Compared with AHF group and control group，serum ALT levels in treatment group were significantly lower(P＜0.01);The average level of serum total bilirubin(TBIL)in treatment group was lower，and the average level of serum plasma prothrombin activity (PTA)was higher after 2 weeks(P＜0.01);The level of TNF-a in treatment group was lower during treatment(P＜0.01).The levels of plasma endotoxin and interleukin-6 in treatment group were significantly lower after 2 weeks(P＜0.01).The masccline rate of proliferation cell nuclear antigen in treatment group was higher than those of control group after 2 weeks(P＜0.01).Conclusion CG can protect AHL of rat model，and the mechanism could be concerned with decreasing levels of endotoxin and cytokine，promoting express of proliferation cell nuclear antigen.

2011－11－04

河南省南陽市中心醫(yī)院，河南南陽473009