少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子對(duì)其促增殖作用研究

段朝霞 張潔元 陳魁君 王建民 李兵倉(cāng)

1.創(chuàng)傷、燒傷、復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042；2.第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所六室，重慶 400042

少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，它的主要功能是產(chǎn)生髓鞘包繞神經(jīng)軸突，維持神經(jīng)沖動(dòng)沿軸突跳躍性傳導(dǎo)；另外它還分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，支持神經(jīng)元的生長(zhǎng)與存活[1]。少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）是處于分化早期階段的未成熟細(xì)胞，具有良好的增殖能力，能在體內(nèi)增殖、遷移，最后分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞并為髓鞘形成發(fā)揮重要作用。高純度OPCs的制備、培養(yǎng)是一切研究工作的基礎(chǔ)，目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)大鼠OPCs的培養(yǎng)報(bào)道很多，有關(guān)小鼠OPCs的培養(yǎng)方法及研究報(bào)道還比較少，本文參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的新生大鼠OPCs的培養(yǎng)方法[2-3]，探索小鼠OPCs的培養(yǎng)及鑒定，并研究重組巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（rMIF）對(duì)其增殖活性的影響，為進(jìn)一步深入研究其發(fā)育、分化以及移植治療脊髓損傷等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco產(chǎn)品，100 ×N2 添加物為Invitrogen公司產(chǎn)品，PDGF-AA及bFGF為Peprotech公司產(chǎn)品，山羊抗大鼠NG2 抗體、兔抗大鼠GFAP及MBP抗體均為BD公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為Invitrogen產(chǎn)品，多聚賴氨酸及多聚鳥(niǎo)氨酸為Sigma公司產(chǎn)品，rMIF及拮抗劑ISO-1 為Sigma公司產(chǎn)品，MTT試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。倒置相差顯微 鏡 （Olympus）、 熒 光 顯 微 鏡 （Leica）、 酶 標(biāo) 儀 （Thermo labsysytems）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)6～8周齡C57B6 小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量18～25g。由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院（所）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 混合膠質(zhì)細(xì)胞的制備

實(shí)驗(yàn)之前，先將D-Hanks液預(yù)冷，取5～8 mL于10 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿里，并將培養(yǎng)皿放于冰上。取新生C57B6 小鼠（生后48 h內(nèi)），斷頸處死后將頭埋于冰中1～5min，然后浸入預(yù)冷的75%乙醇中消毒。將斷頭放入有預(yù)冷D-Hanks液的培養(yǎng)皿中清洗酒精，再將斷頭放入有預(yù)冷D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，用鑷子壓住鼻部，沿圖1 所示的虛線位置依次剪開(kāi)新生小鼠腦皮膚、顱骨，取出腦組織，在解剖顯微鏡下用眼科鑷依次剝除腦膜及血管，取大腦（剔除海馬部分，如圖1 所示）置于另一個(gè)有預(yù)冷D-Hanks液的培養(yǎng)皿中（1次可做5～10只新生小鼠），用眼科剪將組織剪碎，加入0.05%胰酶，用移液槍輕輕吹打幾次（所有過(guò)程在冰上操作），充分混勻后，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15min，期間混勻幾次，然后加入含血清培養(yǎng)基終止消化。再用70 m細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，將收集的細(xì)胞懸液800 r/min離心5min，棄上清液，再用D-Hanks液清洗一次細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后將混合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

將上一步制備好的細(xì)胞懸液按106/mL密度種植于75cm2的玻璃培養(yǎng)瓶中，放入5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，輕輕吸出細(xì)胞懸液（以去除已貼壁的成纖維細(xì)胞）接種于預(yù)先用多聚賴氨酸處理過(guò)的75cm2的一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2培育箱培養(yǎng)。第3 天半量換液，以后每3 天完全換液培養(yǎng)，直到9～10 d。顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞，可見(jiàn)瓶底已被星形膠質(zhì)細(xì)胞鋪滿，上層可見(jiàn)散在較多的小圓形折光性好的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。

1.4 少突膠質(zhì)細(xì)胞的振蕩分離和差速貼壁純化

第10 天時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋擰緊，用封口膜封口，放于37℃恒溫振動(dòng)搖床150 r/min，震搖1 h，吸出所有培養(yǎng)上清，再加入新鮮培養(yǎng)基以去除小膠質(zhì)細(xì)胞等雜細(xì)胞，然后以300 r/min速度振蕩18～20 h。吸出細(xì)胞懸液加入未經(jīng)多聚鳥(niǎo)氨酸處理的玻璃培養(yǎng)瓶中，60 min后吸出細(xì)胞懸液 （此步驟可除去體積較大的星形膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞）放入離心管內(nèi)，800 r/min離心5min，然后無(wú)血清培養(yǎng)液（DMEM-F12，含0.5%胎牛血清、5mL/L的 N2、10 g/L的 PDGF-AA、10 g/L的 bFGF）重懸細(xì)胞，接種于預(yù)先用多聚鳥(niǎo)氨酸處理過(guò)的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，每2 d半量換液。

1.5 少突膠質(zhì)細(xì)胞前體系的鑒定

每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合時(shí)采用抗NG2、PDNFR、GFAP、MBP抗體進(jìn)行少突膠質(zhì)細(xì)胞前體系的免疫組化鑒定，同時(shí)用Hoechst33342 標(biāo)記細(xì)胞核。將細(xì)胞標(biāo)本用新鮮配制的4%多聚甲醛固定10 min；PBS漂洗3次，每次5min；封閉山羊血清或1%BSA室溫下封閉30 min；加入大鼠抗小鼠 NG2、PDGFR、GFAP、MBP 單克隆抗體（1∶100），4℃孵育過(guò)夜或 37℃孵育 2 h，PBS 漂洗 3 次，每次5min；加入不同熒光標(biāo)記的山兔抗大鼠 IgG（1∶1 000）二抗混合工作液，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5min；再用5μg/mL的Hoechst33342 工作液室溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5min；最后用防止熒光淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇九個(gè)視野，相應(yīng)激發(fā)光下分別觀察NG2、PDNFR、GFAP、MBP 抗體及 Hoechst33342 染色結(jié)果。

1.6 細(xì)胞增殖的測(cè)定

用甲基噻唑基四唑（MTT）試劑盒檢測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。將細(xì)胞按104/孔種植于96 孔板，待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)加入不同濃度的MIF，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加10 μL MTT試劑，輕輕混合均勻后，將培養(yǎng)板放于37℃孵育3 h，孵育結(jié)束后，96 孔板底部可見(jiàn)黑色顆粒狀物質(zhì)；輕輕吸掉上層液體，注意不要將黑色顆粒吸出；每孔加入100 μL顆粒溶解液，混勻后成用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)吸光度值。MIF用5、10、20、40、80 μg/L 5個(gè)濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng) 4～5d后開(kāi)始出現(xiàn)分層現(xiàn)象，下層為星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞胞體大，培養(yǎng) 7～8 d，星形膠質(zhì)細(xì)胞逐漸融匯連成一片，折光性弱；星形膠質(zhì)細(xì)胞上面貼附著一些對(duì)稱雙極或三極突起的細(xì)胞，為OPCs或小膠質(zhì)細(xì)胞，它們胞體小，折光性好。

2.2 OPCs的純化與觀察

150 r/min振蕩1 h后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞表層松散附著的小膠質(zhì)細(xì)胞大量脫落，可見(jiàn)大量呈圓形或梭形，簇狀聚集的OPCs，經(jīng)二次振蕩純化后的OPCs胞體呈小圓形，接種到鳥(niǎo)氨酸處理后培養(yǎng)板上很快開(kāi)始貼壁。2～3 d后細(xì)胞呈卵圓形、梭形或三角形，大多數(shù)具有典型的雙極突起，部分為三極、多級(jí)突起（圖2）。

2.3 OPCs的鑒定

純化的OPCs培養(yǎng)2～3 后可做熒光免疫組化鑒定。結(jié)果顯示，OPCs特異性抗原NG2 及PDGFR雙抗陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)90%以上。神經(jīng)元特異性抗原MAP陰性，星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗原GFAP陽(yáng)性細(xì)胞約占5%（圖3）。

2.4 MIF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果用吸光度OD值表示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，低劑量rMIF能顯著促進(jìn)肺少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖，并具有劑量相應(yīng)關(guān)系（P<0.01），而高劑量rMIF則抑制少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖（P<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度重組巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子對(duì)OPC增殖情況影響

3 討論

OPCs是CNS中的一類干細(xì)胞樣細(xì)胞，它能不斷增殖，并最終分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元。要弄清楚OPCs的發(fā)育、分化以及在CNS中的更多作用及機(jī)制，首先需要建立一個(gè)簡(jiǎn)便有效的離體培養(yǎng)方法。近年來(lái)，對(duì)于大鼠的OPCs的培養(yǎng)方法很多，如密度梯度法、免疫吸附法、神經(jīng)干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)法、振蕩分離純化法等[4-5]，但參照這些方法培養(yǎng)小鼠OPCs效果卻不理想，并且密度梯度法操作復(fù)雜，容易引起細(xì)胞死亡，所獲得的細(xì)胞純度也低；而免疫吸附法及神經(jīng)干細(xì)胞定向分化培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)儀器要求高，操作過(guò)程繁瑣，實(shí)驗(yàn)成本高。本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外新生大鼠的培養(yǎng)方法及Dincman等[6]的新生小鼠OPCs的培養(yǎng)方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的具體條件，采用振蕩分離及差速貼壁的純化方法，按照Dincman等[6]的方法采用添加有 N2、PDGF-AA、bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，結(jié)果獲得了較高純度及高密度的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系。國(guó)外文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道小鼠OPCs的制備，一般采用免疫磁珠法純化，這方法純化OPCs成本比較大，另外由于OPCs在不同發(fā)育階段表達(dá)的特異性標(biāo)志蛋白不一樣，使用免疫磁珠法純化的OPCs數(shù)量太少。

本實(shí)驗(yàn)采用新生小鼠獲得了較高純度OPCs，分析原因有主要以下幾方面：①所有步驟都在冰上操作，保持細(xì)胞活性。②在剝除腦膜時(shí)，應(yīng)該在解剖顯微鏡下操作，保證腦膜及血管等組織完全剝離，這樣會(huì)減少雜細(xì)胞污染。③腦膜剝離干凈的腦組織盡量用眼科剪剪碎，否則組織塊太大，胰酶不易消化完全，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)量低。④收集細(xì)胞時(shí)離心速率不要太高，800 r/min即可，重懸細(xì)胞時(shí)不要用移液槍反復(fù)吹打，否則影響細(xì)胞活力。⑤采用無(wú)血清培養(yǎng)基非常重要，既可增加OPCs的產(chǎn)量，也可使細(xì)胞保持未分化狀態(tài)[9-10]。如果采用含血清培養(yǎng)基則容易分化成星型膠質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)GFAP抗原；若不添加任何成分，則細(xì)胞基本不生長(zhǎng)，不容易存活，并容易分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)細(xì)胞從形態(tài)上觀察是典型的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系；特異性抗體的免疫熒光圖片顯示其在整個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞膜及突起上均有表達(dá)，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為少突膠質(zhì)祖細(xì)胞及未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞純化率達(dá)90%以上。

MIF是T細(xì)胞來(lái)源的一種可溶性淋巴因子，最初發(fā)現(xiàn)它可抑制巨噬細(xì)胞的遷移并在炎癥局部活化巨噬細(xì)胞，并且它可作為垂體激素和免疫調(diào)節(jié)劑及促炎細(xì)胞因子發(fā)揮作用。在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，能夠表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞及脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞。在大鼠脊髓損傷后，腦脊液中的MIF表達(dá)迅速增加；在其他腦部疾病如中風(fēng)、腦缺血缺氧等損傷過(guò)程中，MIF的表達(dá)有明顯的變化[11-13]，說(shuō)明MIF在腦損傷及修復(fù)過(guò)程中起著非常重要的作用。本研究初步證實(shí)，MIF可促進(jìn)OPCs增殖，說(shuō)明MIF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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