高水溶性鉑類抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)與合成

張啟飛 魯彥會(huì) 劉朋興 王松青 高清志

天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 天津市現(xiàn)代藥物傳遞及功能高效化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

鉑類抗癌藥是腫瘤治療領(lǐng)域具有代表性的一類藥物。目前世界上廣泛應(yīng)用于臨床治療的具有代表性的鉑類抗癌藥主要有順鉑、卡鉑和奧沙利鉑[1-2]。自1978年美國(guó)FDA批準(zhǔn)順鉑作為抗腫瘤藥上市以來(lái)對(duì)它的作用機(jī)制的研究已經(jīng)非常透徹，這也帶動(dòng)了鉑類有機(jī)金屬化合物在腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，為設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)具有新的分子結(jié)構(gòu)的鉑類抗腫瘤藥物奠定了基礎(chǔ)[3]。

鉑類抗癌藥物的致命缺點(diǎn)是具有極強(qiáng)的毒副作用以及固有的和后續(xù)形成的耐藥性問(wèn)題。另外由于此類藥物是金屬有機(jī)化合物，所有鉑類上市藥物普遍存在水溶性極低的特性，給藥品制劑的穩(wěn)定性和臨床應(yīng)用帶來(lái)了很多的不利影響，比如很難把這些難溶性藥物順利地配制成一種方便合適的劑型。繼順鉑之后開(kāi)發(fā)成功的卡鉑（美國(guó)BMS開(kāi)發(fā)）由于從結(jié)構(gòu)上降低了藥物對(duì)DNA的反應(yīng)性，臨床應(yīng)用近年逐步擴(kuò)大，有取代順鉑各種臨床應(yīng)用的趨勢(shì)。但是，卡鉑并沒(méi)有從根本上解決順鉑存在的耐藥性問(wèn)題，也沒(méi)有從根本上改變藥物的水溶性問(wèn)題，很難避免藥物存在的致命缺點(diǎn)：嚴(yán)重的腎毒性副作用以及臨床制劑的穩(wěn)定性問(wèn)題[4]。奧沙利鉑雖然在某種程度上降低了順鉑和卡鉑存在的耐藥性問(wèn)題，但其在針對(duì)多種腫瘤的臨床應(yīng)用中并沒(méi)有超越順鉑和卡鉑的治療效果，也沒(méi)有從根本上解決鉑類藥物極強(qiáng)的毒副作用和極低的水溶性問(wèn)題。鉑類藥物的水溶性不僅直接關(guān)系到藥物的制劑工藝和臨床應(yīng)用，還直接影響到鉑類藥物的藥效學(xué)及毒理特征。增加藥物的水溶性一方面可以延緩藥物被水解的速度，提高半衰期，另一方面水溶性高的鉑類化合物可以有效地被腎臟排出，減少此類藥物對(duì)腎臟的毒副作用[5]。本文采用糖分子偶聯(lián)方法設(shè)計(jì)與合成了具有極高水溶性的新型鉑類抗腫瘤化合物，其水溶性與順鉑相比提高了600 倍并在初步的動(dòng)物模型抗腫瘤試驗(yàn)中顯示了優(yōu)于順鉑和卡鉑的藥效以及藥物安全性。

1 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)及合成路線

1.1 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)

本文選用常見(jiàn)的葡萄糖作為載體，通過(guò)1-位活潑的羥基連接側(cè)鏈后，再與丙二酸鉑環(huán)己二胺絡(luò)合物進(jìn)行偶聯(lián)得到含糖分子結(jié)構(gòu)的鉑類抗腫瘤化合物（圖1）。利用糖分子結(jié)構(gòu)的高水溶性特點(diǎn)提高鉑類化合物的溶解度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)降低藥物毒副作用的目的。

1.2 目標(biāo)化合物的合成路線

本文所采用的制備方法是將鹵代醇先與葡萄糖在路易斯酸存在下進(jìn)行縮合，然后進(jìn)行與丙二酸酯衍生物的取代反應(yīng)，接下來(lái)進(jìn)行水解，最后在堿性條件下與環(huán)己二胺硫酸鉑絡(luò)合物進(jìn)行反應(yīng)得到目標(biāo)化合物。合成路線見(jiàn)圖2。本制備路線中涉及在路易斯酸存在下的葡萄糖苷合成反應(yīng)、葡萄糖的乙?；⒈狨サ?-位取代反應(yīng)以及最后的脫保護(hù)反應(yīng)[6-7]。

2 合成方法及結(jié)果

核磁共振氫譜用德國(guó)Brucker AC-400 型核磁共振波譜儀測(cè)定。質(zhì)譜采用Agilent 6310 Ion Trap LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。

2.1 1-O-D-葡萄糖苷-2-溴-乙烷的制備

在室溫條件下將葡萄糖（2.7 g）加入到2-溴乙醇（10 mL）中，冷卻到0℃后用氮?dú)庵脫Q燒瓶?jī)?nèi)空氣，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下慢慢滴加三氟化硼的乙醚溶液（98%，1 mL）。將反應(yīng)液在0℃攪拌15min，然后慢慢升溫到室溫并攪拌30 min，然后將反應(yīng)液加熱到80℃，在80℃反應(yīng)5h。反應(yīng)完成后，旋蒸除去溶劑，使用硅膠柱色譜（二氯甲烷∶甲醇=6∶1）對(duì)反應(yīng)生成物實(shí)施簡(jiǎn)單純化，得到粗產(chǎn)品 2.3 g。 質(zhì)譜：MS，m/z：287.23[M+1]+。

2.2 1-O-（2，3，4，6-四乙?；?D-葡萄糖苷）-2-溴-乙烷的制備[7-8]

在室溫條件下，將“2.1”項(xiàng)下反應(yīng)得到的產(chǎn)品1-O-D-葡萄糖苷-2-溴-乙烷2.3 g溶解于吡啶與乙酸酐 （7 mL∶7 mL）中，攪拌過(guò)夜，用薄層色譜法（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完成后，加入100 mL乙酸乙酯，用體積濃度為5%的鹽酸水溶液（25mL，2 次）洗滌，將水相用乙酸乙酯（25mL，2 次）萃取，合并有機(jī)相。將有機(jī)相依次用飽和氯化銨水溶液（100 mL，1次），蒸餾水（100 mL，1 次），飽和碳酸氫鈉水溶液（100 mL，1 次），飽和氯化鈉水溶液（100 mL，1次）洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸干，得到微黃色粗產(chǎn)品。得到的粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱色譜純化（石油醚∶乙酸乙酯=3∶1），得到無(wú)色油狀目的產(chǎn)物 3.5g，兩步收率為 51.3%。1H-NMR（400 MHz，CDCl3），δ 5.45（1H，t，J=9.6 Hz），5.15（1H，d，J=4 Hz），5.02（1H，t，J=9.6 Hz），4.80～4.83 （1H，m），4.19～4.23 （1H，m），4.04～4.15（2H，m），3.92～4.00（1H，m），3.75～3.85（1H，m），3.49（2H，t，J=6 Hz），1.91～2.11（12H，m）。 質(zhì)譜：MS，m/z：455.15[M+1]+

2.3 1-O-（2，3，4，6-四乙?；?D-葡萄糖苷）-丙烷-3，3-二甲酸二乙酯的制備[9-10]

將“2.2”項(xiàng)下反應(yīng)得到的產(chǎn)品 1-O-（2，3，4，6-四乙?；?D-葡萄糖苷）-2-溴-乙烷（2.5g）溶解于 5mL 干燥的 N，N-二甲基甲酰胺中，向反應(yīng)液中加入碳酸鉀（3 g）及丙二酸二乙酯（1.76 g），室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)完成后，向反應(yīng)液中加入100 mL乙酸乙酯，然后用飽和氯化銨水溶液（50 mL，1次）洗滌，將水相用乙酸乙酯萃取（25mL，2次），合并有機(jī)相。將有機(jī)相依次用飽和氯化銨水溶液（100 mL，1 次），蒸餾水（100 mL，1 次），飽和氯化鈉溶液（100 mL，1次）洗滌，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸干，得到的淡黃色油狀物用硅膠柱色譜純化（石油醚∶乙酸乙酯=3∶1），得到無(wú)色透明油狀目的產(chǎn)物2.6 g，收率為88.5%。1H-NMR（400 MHz，CDCl3），δ 5.42（1H，t，J=9.6 Hz），4.96～5.10（2H，m），4.78～4.90（1H，m），4.03～4.33（5H，m），3.92～4.02（1H，m），3.71～3.87（1H，m），3.71～3.87（1H，m），3.55（1H，t，J=8 Hz），3.40～3.50（1H，m），2.13～2.28（2H，m），1.94～2.14（12H，m），1.15～1.35（6H，m）。 質(zhì)譜：MS，m/z：535.34[M+1]+

2.4 1-O-D-葡萄糖苷-丙烷-3，3-二甲酸的制備[11-12]

將 1-O-（2，3，4，6-四乙?；?D-葡萄糖苷）-丙烷-3，3-二甲酸二乙酯（2.6 g，）溶解于5mL甲醇中。將氫氧化鈉（1.6 g）溶解于10 mL水中，室溫下加入到反應(yīng)液中，然后升溫至60℃反應(yīng)24 h。用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)。待反應(yīng)完成后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇，使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂處理產(chǎn)品。將過(guò)濾得到的水溶液用冷凍干燥機(jī)干燥后得到無(wú)色黏稠狀液體1.3 g，粗產(chǎn)品直接用于下步反應(yīng)。質(zhì)譜：MS，m/z：311.25[M+1]+。

2.5 順-[反式-（1R，2R）-二氨基環(huán)己烷]鉑（Ⅱ）（1-O-D-葡萄糖苷-丙烷-3，3-二甲酸酯）的制備[13-14]

將 1-O-D-葡萄糖苷-丙烷-3，3-二甲酸粗產(chǎn)品（1.3 g）溶解于15mL水中，加入八水合氫氧化鋇1.3 g，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下將環(huán)己二胺硫酸鉑（1.7 g）溶解于2 mL水中，加入到上述反應(yīng)液中，反應(yīng)在室溫避光攪拌過(guò)夜。待反應(yīng)完成后，使用離心機(jī)除去沉淀，收集上清液，使用冷凍干燥機(jī)凍干，用半制備高壓液相色譜分離得到1.5g最終產(chǎn)品，兩步反應(yīng)總收率為51.9%，白色固體。1H-NMR（400 MHz，D2O），δ 4.80（0.8H，d，J=3.6 Hz），4.25（0.2H，d，J=7.2 Hz），4.18（1H，m），3.12～3.90（8H，m），2.30～2.45（2H，m），2.20～2.30（2H，m），1.82～1.96（2H，m），1.44（2H，d，J=9.6 Hz），1.15～1.24（2H，m），0.95～1.15（2H，m），質(zhì)譜：MS，m/z：618.36[M+1]+。

2.6 水中飽和溶液溶質(zhì)質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

為了比較本研究中糖分子偶聯(lián)后鉑類抗腫瘤化合物與上市藥物順鉑、卡鉑以及奧沙利鉑在水溶性方面的不同，本研究分別針對(duì)所取得的化合物以及上述3 種上市藥物進(jìn)行了室溫下藥物的在水中飽和溶液溶質(zhì)質(zhì)量測(cè)定。

結(jié)果表明，本研究中糖分子偶聯(lián)后鉑類抗腫瘤化合物在水中的溶解度大于600 mg/mL，與最具代表性的臨床藥物順鉑（1 mg/mL）、卡鉑（17 mg/mL）以及奧沙利鉑（6 mg/mL）相比其水溶性得到了非常顯著的提高。根據(jù)筆者的文獻(xiàn)調(diào)查，取得具有如此高水溶性的有機(jī)鉑類抗腫瘤化合物，本研究屬于首次。

2.7 糖分子偶聯(lián)鉑配合物動(dòng)物模型抗腫瘤藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在下述試驗(yàn)中，試驗(yàn)用動(dòng)物為8～9周齡的雌性CDF1 種鼠，動(dòng)物體重為20～25g。用L1210 細(xì)胞（每只動(dòng)物約105個(gè)細(xì)胞）由腹膜內(nèi)接種，本研究所得化合物以及臨床藥物順鉑以及卡鉑在動(dòng)物模型抗腫瘤試驗(yàn)中的藥效結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)于本研究中取得的糖分子偶聯(lián)鉑類抗腫瘤化合物和卡鉑，使用5%甘露糖醇水溶液（V/V），對(duì)于順鉑則使用5%甘露糖醇生理鹽水溶液（V/V）。在腫瘤細(xì)胞移植后第1、4 天經(jīng)由腹腔內(nèi)注射藥物，每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)目為6。

動(dòng)物壽命延長(zhǎng)（ILS）的計(jì)算方法如下：

ILS（%）=[（St/Su）-1]×100%

其中，St=接受治療的動(dòng)物存活日的加權(quán)中間數(shù)；Su=未接受治療的動(dòng)物存活日的加權(quán)中間數(shù)。

表1 糖分子偶聯(lián)鉑配合物動(dòng)物模型抗腫瘤藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 結(jié)果顯示，本研究中所取得的高水溶性糖分子偶聯(lián)鉑類抗腫瘤化合物在上述動(dòng)物試驗(yàn)中取得了安全性和抗腫瘤藥效均優(yōu)于臨床藥物順鉑和卡鉑的結(jié)果。本研究化合物最小劑量組（50.0 mg/kg，相當(dāng)于0.08 mmol金屬鉑）與卡鉑最大劑量組（80.0 mg/kg，相當(dāng)于0.20 mmol金屬鉑）以及順鉑最大劑量組（5.0 mg/kg，相當(dāng)于0.02 mmol金屬鉑）比較，藥效均顯著。在藥物的安全性方面，本研究初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本文所制得化合物不論在動(dòng)物體重變化以及第42 天動(dòng)物殘存數(shù)量上都優(yōu)于臨床藥物順鉑和卡鉑。

3 討論

本研究為了設(shè)計(jì)與合成具有高水溶性的鉑類抗腫瘤藥物，通過(guò)在丙二酸鉑結(jié)構(gòu)中偶聯(lián)糖分子設(shè)計(jì)出目標(biāo)化合物并合成取得水溶性抗腫瘤藥物。結(jié)果得到了迄今水溶性最好的金屬鉑類抗腫瘤化合物，其動(dòng)物模型抗腫瘤活性和安全性均優(yōu)于順鉑和卡鉑。提示通過(guò)糖分子偶聯(lián)設(shè)計(jì)取得的新型鉑類抗腫瘤藥物能夠解決一般鉑類藥物的低水溶性問(wèn)題，經(jīng)初步動(dòng)物模型抗腫瘤藥效實(shí)驗(yàn)證明該類藥物具有理想的抗腫瘤效果。

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