絞股藍皂甙對Aβ誘導AD細胞模型的影響1）

鄭艷麗，孫天敏，王 萌，李瑞花，姚柏春，譚華炳

阿爾茨海默?。ˋ1zheimer’s disease，AD）主要病理特征是大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球、基底前腦神經(jīng)元喪失、神經(jīng)突觸減少，細胞外存在大量由β－淀粉樣蛋白（β－amyloid，Aβ）組成的老年斑（senile plaques，SP）、神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)纖維絲纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）。關于AD的發(fā)病機制尚無定論。目前臨床治療AD的藥物只能緩解某些癥狀如改善AD患者學習記憶功能，既無有效方法緩解病情進展，也無法補充大腦皮層、基底前腦和海馬大量丟失的神經(jīng)元、神經(jīng)突觸和神經(jīng)遞質(zhì)［1，2］。近幾年研究表明，絞股藍皂甙（stevenleafs，SLs）具有抗衰老、增強機體免疫以及顯著的抗氧化與神經(jīng)保護功能［3］，但SLs對AD治療作用的研究報道很少［4］。本實驗首先原代培養(yǎng)胎鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元，應用 MTT［3－（4，5－Dimethylthiazol－2－yl）－2，5－diphenyltetrazolium bromide］比色試驗檢測SLs對細胞活性的影響。然后采用大鼠β淀粉樣蛋白1－40（rat amyloid beta peptide 1－40，Aβ1－40）誘導膽堿能神經(jīng)元損傷，在體外建立 AD細胞模型。運用免疫細胞化學染色和流式細胞儀分別檢測誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達和凋亡，觀察SLs對Aβ1－40誘導膽堿能神經(jīng)元損傷的影響，為SLs用于臨床防治AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 孕15d～16dSD大鼠2只，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心［許可證號：SCXK（鄂）2005－0008］提供。SLs購自上海億欣生物科技有限公司，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）購自美國 Promage公司。大鼠Aβ1－40、多聚賴氨酸、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司。Annexin V－FITC／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢天源生物科技公司，兔抗人膽堿乙酰轉移酶抗體（rabbit anti－h(huán)uman choline acetyltransferase，ChAT Antibody）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase，iNOS）一抗、SABC試劑盒、胎牛血清、DMEM購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 基底前腦神經(jīng)元培養(yǎng) 孕15d～16dSD大鼠2只，無菌條件下，取胚鼠基底前腦原基，小心剝除軟腦膜，用眼科剪將其剪成小碎塊，并向其中加入0.25%胰蛋白酶，37℃水平搖床消化5min。用含血清的培養(yǎng)基（高糖EMEM＋2mmol／L谷氨酰胺＋0.1U／mL胰島素＋10%FBS）阻止消化，吹打混勻，1 000r／min離心10min；去上清，用含血清完全培養(yǎng)基（含B27，2%，V／V）重懸細胞，200目尼龍網(wǎng)過濾；細胞計數(shù)后，制成密度為1×106／mL細胞懸液，接種于預先包被多聚賴氨酸的96孔板，每孔1.0×105個細胞，在37℃含5%CO2和95%空氣的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.5h、24h各換1次培養(yǎng)液，第3天添加阿糖胞苷（4mg／L），之后每隔3d換液1次。

1.2.2 建立AD細胞模型 將Aβ1－40溶于無菌生理鹽水（5 μg／mL），放入37℃溫箱孵育2周，使其變成絲狀聚集狀態(tài)。接種后第4天將細胞分為6組：空白對照組、BDNF組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組，每組設16個復孔。換液時，BDNF組、Aβ1－40＋BDNF組加入BDNF，終濃度為100μg／L；SLs組、Aβ1－40＋SLs組培養(yǎng)液中加入 SLs，終濃度400μg／mL［5］；Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組均加入Aβ1－40，終濃度為10μg／mL；空白對照組加入等量培養(yǎng)液。1.2.3 MTT比色試驗檢測各組細胞活性 各干預因子作用48h后對各組細胞進行MTT比色試驗。各組每孔加入20μL MTT（5g／L），繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加200L DMSO溶液終止反應，溫和振蕩10min，使藍紫色結晶充分溶解；然后在酶標儀上波長為570nm檢測細胞積分吸光度（integral absorbance，IA），以IA值間接反映細胞存活數(shù)量及其功能狀態(tài)。

1.2.4 各組ChAT免疫陽性細胞數(shù)觀察 重新接種細胞于多聚賴氨酸包被的圓形蓋玻片，置入24孔板爬片，各干預因子作用48h后，結合SABC試劑盒說明，對各組細胞進行ChAT免疫細胞化學染色。常規(guī)清洗各組細胞，用4%多聚甲醛固定10 min，封閉，分別加入一抗ChAT抗體，置4℃冰箱過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗IgG（1∶75）室溫孵育30min，DAB顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀察。陰性對照用抗體稀釋液代替一抗作用，未見明顯的細胞著色。倒置顯微鏡下觀察并進行ChAT免疫反應陽性神經(jīng)元計數(shù)。

1.2.5 各組神經(jīng)元iNOS陽性表達的觀察 各干預因子作用48h后，采用SABC法進行iNOS免疫細胞化學染色：分別加入一抗iNOS抗體，4℃搖床上孵育過夜；二抗為生物素化的羊抗兔Ig G（1∶100），室溫搖床上孵育1.5h；ABC液室溫搖床上孵育1.5h；DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片。Olympus顯微鏡觀察并計數(shù)視野中iNOS免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)量。iNOS免疫細胞化學染色替代對照實驗：用0.1mol PBS取代iNOS抗體，結果為陰性。

1.2.6 各組神經(jīng)元凋亡檢測 各干預因子作用48h后，參照試劑盒說明進行AnnexinV－FITC／PI雙染色流式細胞儀檢測細胞的早期凋亡率。各組細胞培養(yǎng)于25cm2細胞培養(yǎng)瓶，用1.25 g／L胰酶＋0.2g／L EDTA消化并收集到10mL離心管中，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×106個／mL，取1mL細胞，1 000r／min離心5min，棄上清，加入1mL冷PBS重懸細胞，1 000r／min離心5min，棄上清，細胞重懸于250μL結合緩沖液，加入10μL Annexin V－FITC和5μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應15min，加入250μL結合緩沖液，立即進行流式細胞儀檢測，數(shù)據(jù)由軟件收集和分析。相同方法重復檢測5次。1.2.7 統(tǒng)計學處理 光鏡下陽性細胞計數(shù)：計數(shù)每張10個隨機視野中免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)后取平均值作為計數(shù)結果，5張玻片計數(shù)結果取平均值為最后結果。實驗測定值采用均數(shù)±標準差（±s）表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。對檢測結果進行方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結 果

2.1 SLs對培養(yǎng)細胞生長的影響 接種后24h培養(yǎng)的神經(jīng)元均已貼壁，多呈圓形，體積小，立體感強，彼此分散，細胞突起不明顯。培養(yǎng)3d后，神經(jīng)元生長良好，形態(tài)多樣，從多極到梭形，胞體飽滿，細胞間突起聯(lián)系廣泛。各干預因子作用48h后，空白對照組細胞數(shù)目少，突起較細；BDNF組、SLs組細胞數(shù)目相對增多，胞體增大，突起明顯增粗、延長、分支多，相鄰細胞突觸相互連接成網(wǎng)；Aβ1－40組較空白對照組細胞數(shù)目少，部分細胞皺縮，突起明顯變細、變短、分支少，相鄰細胞間突觸減少、相互連接稀疏；Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組神經(jīng)元生長狀況較Aβ1－40組明顯好轉，神經(jīng)元數(shù)量增多，胞體飽滿，突起增多、增粗、增長，相鄰神經(jīng)元間突觸較多、連接致密。

2.2 SLs對細胞活性的影響 空白對照組、BDNF組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組細胞積分吸光度（IA）分別為0.61±0.04、0.91±0.07、0.92±0.07、0.36±0.02、0.56±0.04、0.55±0.04。SLs組細胞活性較空白對照組高（P＜0.05），與BDNF組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Aβ1－40＋SLs組細胞活性較 Aβ1－40組高（P＜0.05），與 Aβ1－40＋BDNF組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見圖1。

圖1 各處理組細胞IA值的比較

2.3 免疫細胞化學染色觀察ChAT陽性細胞數(shù) 空白對照組、BDNF組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF組和 Aβ1－40＋SLs組ChAT陽性細胞數(shù)分別為43.00±2.73、64.00±4.57、61.00±4.62、21.00±1.92、41.00±2.69、40.00±2.54，SLs組與BDNF組ChAT陽性細胞數(shù)均高于空白對照組（P＜0.05），SLs組與BDNF組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Aβ1－40＋SLs組和Aβ1－40＋BDNF組ChAT陽性細胞數(shù)均高于 Aβ1－40組（P＜0.05），Aβ1－40＋SLs組與 Aβ1－40＋BDNF組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ChAT免疫細胞化學染色結果見圖2。

圖2 各處理組ChAT免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)

2.4 SLs預處理對Aβ1－40誘導神經(jīng)元的iNOS表達的影響 空白對照 組、BDNF 組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF 組 和Aβ1－40＋SLs組iNOS免疫染色陽性細胞數(shù)分別為4 1.0 0±2.92、40.00±2.89、40.00±2.96、67.00±5.26、46.00±2.78、45.00±2.97。與空白對照組比較，Aβ1－40組iNOS免疫細胞化學染色陽性細胞數(shù)目明顯增多（P＜0.05）；與 Aβ1－40組比較，Aβ1－40＋SLs組和 Aβ1－40＋BDNF組iNOS免疫陽性細胞數(shù)減少（P＜0.05），說明SLs預處理可有效抑制 Aβ1－40誘導神經(jīng)元的iNOS表達的增加。詳見圖3。

圖3 SLs對Aβ1－40誘導的iNOS表達的抑制作用

2.5 SLs預處理對細胞凋亡的影響 在流式細胞儀測定中，Annexin V／PI雙染色分出凋亡細胞、壞死細胞和正常細胞，空白對照 組、BDNF 組、SLs組、Aβ1－40組、Aβ1－40＋BDNF 組 和Aβ1－40＋SLs組細胞凋亡5次檢測結果相近，6組細胞凋亡數(shù)分別為30.00±2.31、29.00±2.12、28.00±2.49、57.00±3.83、33.00±1.75、34.00±3.46。與空白對照組比較，Aβ1－40組細胞凋亡數(shù)增高（P＜0.05）；與 Aβ1－40組比較，SLs＋Aβ1－40組和Aβ1－40＋BDNF組細胞凋亡數(shù)降低（P＜0.05），說明SLs預處理對Aβ1－40誘導的細胞凋亡具有明顯抑制作用。詳見圖4。

圖4 各組細胞凋亡率比較

3 討 論

基底前腦聚集著神經(jīng)系統(tǒng)約30%膽堿能神經(jīng)元，又是海馬膽堿能傳入纖維的起源?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元丟失與海馬結構內(nèi)膽堿能傳入神經(jīng)支配的損害是學習記憶減退原因之一。因此，多數(shù)學者認為腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)的損害是造成AD主要可能機制，從而提出了“膽堿能假說”［6］。Aβ是AD腦內(nèi)老年斑的主要結構物質(zhì)，Aβ的毒性作用是AD發(fā)病機制中的中心環(huán)節(jié)。Aβ誘導的AD大鼠模型已廣泛應用于AD實驗研究。本實驗取胚鼠基底前腦原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞，采用大鼠Aβ1－40誘導膽堿能神經(jīng)元損傷，在體外建立AD細胞模型［7］；培養(yǎng)環(huán)境相對穩(wěn)定，可控性很強，有利于排除非處理因素對結果的影響。

BDNF是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應。BDNF分子單體是由119個氨基酸殘基組成的分泌型成熟多肽，蛋白等電點為9199，分子量為1 315kD，主要由β折疊和無規(guī)N－級結構組成。分析表明BDNF的氨基酸序列有相當一部分與神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）相同，故通稱為神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factor，NTF），常用于作為神經(jīng)元保護作用研究的陽性對照藥物。絞股藍皂甙來源于葫蘆科植物絞股藍Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Mak.的全草。屬絞股藍總皂甙的共約有80余種，其中78種分別命名為絞股藍皂甙Ⅰ～LXXVⅢ，其中有一部分分別為人參皂甙Rb1、Rb3、Rd，以及人參二醇、2α－羥基人參二醇，2α，19－二羥基－12－脫氧人參二醇等。其成分的含量測定和成品標準，也都以人參皂甙Rb1的多少作為標準。

本實驗結果提示，Aβ1－40＋SLs組細胞活性與ChAT陽性細胞數(shù)均高于 Aβ1－40組（P＜0.05），Aβ1－40＋SLs組iNOS陽性細胞數(shù)與細胞凋亡數(shù)均低于Aβ1－40組（P＜0.05）。即SLs可促進體外培養(yǎng)的膽堿能神經(jīng)元及其突起生長，可提高神經(jīng)元的活性和ChAT表達；并可有效抑制Aβ1－40誘導的神經(jīng)元iNOS表達和細胞凋亡。我們認為，SLs可能是通過對抗Aβ氧化損傷等途徑來發(fā)揮作用。一方面，SLs對抗Aβ引起的細胞膜損傷，保護細胞膜完整性，降低Ca2＋的通透性，減少Ca2＋內(nèi)流和細胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的大量產(chǎn)生，從而抑制細胞損傷、凋亡或死亡［5］。另一方面，SLs對抗Aβ引起的線粒體膜穩(wěn)態(tài)及完整性的破壞，恢復線粒體電子傳遞鏈和三羧酸循環(huán)中的關鍵酶的活性，改善線粒體功能、抑制細胞凋亡［8］。SLs也可能是通過影響B(tài)ax／bcl－2、細胞色素C、caspase－3等細胞凋亡相關因子活性來抑制細胞凋亡［9］。

本實驗研究證明絞股藍皂甙對Aβ誘導的胚鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷有明顯的拮抗作用，即絞股藍皂甙對Aβ誘導的AD細胞模型具有保護作用；進而為防治AD提供了一種新的活性物質(zhì)。但多數(shù)研究表明［10，11］，絞股藍皂甙防治AD的作用可能是多靶點、多環(huán)節(jié)的結果，其詳細的作用機制尚待進一步的實驗研究。

［1］Wang X，Blanchard J，Kohlbrenner E，etal.The carboxy－terminal fragment of inhibitor－2of protein phosphatase－2Ainduces Alzheimer disease pathology and cognitive impairment［J］.FASEB J，2010，22：1152－1253.

［2］Xu ZQ，Li J，Deng J，etal.Effects of proBDNF on cell proliferation and differentiation in hippocampal dentate gyrus in Alzheimer’s disease rat model［J］.Natl Med J China，2010，90（19）：1353－1356.

［3］Megalli S，Davies NM，Roufogalis BD.Anti－h(huán)yperlipidemic and hypoglycemic effects of Gynostemma pentaphyllum in the Zucker fatty rat［J］.Pharm Pharm Sci，2006，9（3）：281－291.

［4］Shang L，Lu J，Zhu Q，etal.Gypenosides protect primary cultures of rat cortical cells against oxidative neurotoxicity［J］.Brain Res，2006，1102（1）：163－174.

［5］Wang P，Niu L，Guo XD，etal.Gypenosides protects dopaminergic neurons in primary culture against MPP（＋）－induced oxidative injury［J］.Brain Res Bull，2010.

［6］Wan J，F(xiàn)u AK，Ip FC，etal.Tyk2／STAT 3signaling mediates betaamyloid－induced neuronal cell death：Implications in Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2010，30（20）：6873－6881.

［7］Ma W，Yuan L，Yu H，etal.Genistein as a neuroprotective antioxidant attenuates redox imbalance induced by beta－amyloid peptides 25－35in PC12cells［J］.Int J Dev Neurosci，2010，28（4）：289－295.

［8］Chen JC，Lu KW，Lee JH，etal.Gypenosides induced apoptosis in human colon cancer cells through the mitochondria－dependent pathways and activation of caspase－3［J］.Anticancer Res，2006，26（6B）：4313－4326.

［9］Garcia P，Youssef I，Utvik JK，etal.Ciliary neurotrophic factor cellbased delivery prevents synaptic impairment and improves memory in mouse models of Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2010，30（22）：7516－7527.

［10］姚柏春，袁華，黃翔，等.絞股藍對海馬注射Aβ1－40大鼠腦內(nèi)細胞周期蛋白表達和鈣穩(wěn)態(tài)的影響［J］.中國病理生理雜志，2006，22（8）：1618－1622.

［11］姚柏春，袁華，黃翔，等.喂飼絞股藍皂苷對Aβ1－40注射海馬后大鼠腦內(nèi)COX活性和線粒體超微結構變化的影響［J］.中國老年學雜志，2005，25（10）：1193－1195.