應(yīng)用雞胚心臟左心室射血分?jǐn)?shù)評(píng)估擴(kuò)張型心肌病患者自身抑制性抗體的研究

潘偉民 朱云云 許幼峰 陳曉敏 陳立斌 章朝霞 張盛敏 俞霏 孫定河 翁躍頌

·基礎(chǔ)研究·

應(yīng)用雞胚心臟左心室射血分?jǐn)?shù)評(píng)估擴(kuò)張型心肌病患者自身抑制性抗體的研究

潘偉民 朱云云 許幼峰 陳曉敏 陳立斌 章朝霞 張盛敏 俞霏 孫定河 翁躍頌

目的使用心臟超聲對(duì)雞胚心臟左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)測定來評(píng)估擴(kuò)張型心肌病心力衰竭患者是否存在心肌自身抑制性抗體。方法按隨機(jī)數(shù)表法選取36例擴(kuò)張型心肌病心力衰竭患者和23例冠心病心力衰竭患者的IgG血清，滴入18d胚齡的雞胚中，用超聲心動(dòng)圖儀檢測雞胚心肌抑制狀況。結(jié)果冠心病心力衰竭組LVEF為81.03%±2.67%，擴(kuò)張型心肌病心力衰竭組中，心肌自身抑制性抗體陰性13例，其LVEF為81.24%±2.33%，而抗體陽性23例(63.9%)，其LVEF為62.04%±2.98%。結(jié)論擴(kuò)張型心肌病心力衰竭患者中可能存在心肌抑制性抗體。

擴(kuò)張型心肌病;心力衰竭;心肌抑制性抗體;雞胚;心臟超聲

擴(kuò)張型心肌病是一種以左心室或雙心室舒張及收縮功能障礙為特征的原發(fā)性心肌病。目前雖有β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)或心室再同步療法可緩解部分患者的癥狀，但多數(shù)患者最終因心力衰竭而死亡。近年來擴(kuò)張型心肌病心力衰竭的原因被認(rèn)為與自身免疫反應(yīng)有關(guān)，針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的免疫吸附療法正在受到關(guān)注。但重要的是必須首先確定哪些患者體內(nèi)存在心肌抑制性抗體。本研究試圖使用心臟超聲對(duì)雞胚心臟左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)測定來評(píng)估患者體內(nèi)是否存在心肌抑制性抗體。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究入選了36例擴(kuò)張型心肌病和23例冠心病心力衰竭的住院患者。擴(kuò)張型心肌病的診斷按照2008年世界衛(wèi)生組織/國際心臟病學(xué)會(huì)與聯(lián)合會(huì)(WHO/ISFC)的標(biāo)準(zhǔn)，冠心病均通過冠狀動(dòng)脈造影明確診斷，心力衰竭診斷按2007年版《慢性心力衰竭診斷治療指南》的標(biāo)準(zhǔn)。在入選時(shí)，所有患者均有心力衰竭癥狀，紐約心功能分級(jí)(NYHA)Ⅲ～Ⅳ級(jí)，用心臟彩超雙平面改良Simpson法確定LVEF＜45%。

1.2 方法

1.2.1 血清IgG提純所有入選對(duì)象均被抽取血清保存于－80℃冰箱內(nèi)。當(dāng)標(biāo)本備齊后，取冰凍血清溫水解凍，應(yīng)用中科晨宇生物科技提供的抗體純化試劑盒來提純血清IgG，步驟如下:(1)將抗血清低溫15 000×g離心5 min，最上層有漂浮物，最下層有沉淀，取中間層;(2)振蕩懸勻Protein A Sepharose 4 EF;(3)加190～200μl(50%)Protein A Sepharose 4 EF懸液到小離心柱，去掉Tip的尖端; (4)加500μl相應(yīng)的平衡緩沖液到小離心柱，800× g離心1 min;(5)將稀釋的樣品加入小離心柱，加蓋，翻轉(zhuǎn)混勻Protein A Sepharose與樣品，重復(fù)翻轉(zhuǎn)5 min，以使Protein A Sepharose與樣品充分結(jié)合，500×g離心1 min;(6)加500μl相應(yīng)的平衡緩沖液到小離心柱，800×g離心1 min;(7)加400μl相應(yīng)的洗脫緩沖液，800×g離心5 min;(8)為保持抗體活性，洗脫品立刻加入20μl中和緩沖液。將收集的IgG液測定其蛋白含量、活性和純度，確定每份血清標(biāo)本的IgG含量至少為1 mg，然后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雞胚試驗(yàn)檢測心肌抑制性抗體取孵化18 d胚齡的海蘭白胚蛋(慈溪市益大禽業(yè)有限公司)做心臟彩超，首先在雞胚卵圓空氣囊端打1小洞(直徑約2 mm)，滴入麻醉劑10 min后將患者血清提純的IgG (或生理鹽水)加入卵圓空氣囊(1.0 mg/egg)。20 min后，在卵圓空氣囊區(qū)用小血管鉗仔細(xì)剝?nèi)タ諝饽叶说牡皻ぃ曁筋^從此洞探測雞胚的心臟搏動(dòng)(超聲儀型號(hào):GE Vivid 7-12L，探頭頻率:13 MHz)。用M超來重復(fù)測定左心室舒張期內(nèi)徑(LVDd)、左心室收縮期內(nèi)徑(LVDs)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)、LVEF及心率(至少測3次取平均值)。本研究將雞胚按隨機(jī)數(shù)表法分為生理鹽水組(39例)、擴(kuò)張型心肌病組(DCM組，36例)及冠心病心力衰竭組(non-DCM組，23例)。non-DCM組研究對(duì)象的年齡、性別、LVEF值均與DCM組相匹配。首先確定生理鹽水組雞胚的LVEF均數(shù)±SD，存在心肌抑制性抗體定義為LVEF低于均數(shù)－2SD。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，IgG未被細(xì)胞因子或神經(jīng)體液因子包括白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、去甲腎上腺素或尿鈉肽所污染。

1.2.3 N末端腦利鈉肽前體(NT-proBNP)水平的測定血清NT-proBNP檢測采用定量ELISA改進(jìn)法［1］，試劑盒(Biomedica公司，奧地利)，儀器為ST-360多功能酶標(biāo)儀(上海科華)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，計(jì)數(shù)資料用百分構(gòu)成比表示。用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組間比較，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，兩組之間的均數(shù)比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組之間的均數(shù)比較采用方差分析(F檢驗(yàn))，經(jīng)F檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再進(jìn)一步行多重比較，本研究采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)張型心肌病心肌抑制性抗體陽性患者的臨床特征

心肌抑制性抗體陽性(DCM+)和陰性(DCM－)兩組患者的年齡、性別、LVEF及NT-proBNP差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)(見表1)。LVEF和NT-proBNP測定均在抽血測心肌自身抗體的1周內(nèi)完成。

表1 兩組擴(kuò)張型心肌病心力衰竭患者的臨床特征

2.2 各組雞胚心臟彩超指標(biāo)比較

LVDD在各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 1.58，均為P＞0.05)，而LVDS、LVEF、LVFS及心率在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為3.10、3.81、3.76、3.21，均為P＜0.05)，本研究進(jìn)行了各組均數(shù)之間的多重比較(Dunnett-t檢驗(yàn))，結(jié)果提示，較之生理鹽水組，non-DCM組以及DCM－組中各數(shù)據(jù)差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)，而DCM+組中，LVDD與生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)，但LVDS、心率均顯著高于生理鹽水組(P=0.016，P=0.024)，LVEF、LVFS均顯著低于生理鹽水組(P=0.019，P=0.012)。見表2、圖1～2。

表2 各組雞胚心臟彩超的測定值(ˉ±s)

表2 各組雞胚心臟彩超的測定值(ˉ±s)

注:與生理鹽水組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別例數(shù)LVDD(mm)LVDS(mm)LVEF(%)LVFS(%)心率(次/min)生理鹽水組39 0.32±0.06 0.19±0.04 82.20±3.25 47.41±3.11 126.83±13.65 non-DCM組23 0.31±0.05 0.19±0.03 81.13±2.67 46.65±3.11 128.29±15.57 DCM－組13 0.31±0.05 0.20±0.04 81.14±2.33 46.04±2.98 130.17±20.65 DCM+組23 0.31±0.06 0.22±0.02a62.04±2.98b31.12±3.00b141.38±24.67a

3 討論

擴(kuò)張型心肌病的病因尚未完全闡明，可能是以遺傳基因?yàn)榛A(chǔ)，由病毒感染誘發(fā)的自身免疫性疾病，最終可導(dǎo)致嚴(yán)重心力衰竭。目前認(rèn)為部分?jǐn)U張型心肌病與自身免疫有關(guān)，患者體內(nèi)的體液免疫異?？赡芷鹆酥匾淖饔?。許多證據(jù)表明，患者血清中存在抗心肌抗體，這類抗體多數(shù)為β受體抗體和M2受體抗體［2-4］，清除這種心肌抑制性抗體，可能改善心功能?；谶@種認(rèn)識(shí)，一系列免疫相關(guān)療法已試用于臨床，例如免疫吸附療法、血漿置換療法、免疫抑制療法等等［5-6］。

其中免疫吸附治療是目前免疫治療中最主要的形式。然而并非所有擴(kuò)張型心肌病患者均適合做免疫吸附治療［7］，只有治療前心肌抑制性抗體陽性的患者采用該療法有效，反之療效不佳，因此選擇哪種擴(kuò)張型心肌病患者對(duì)于做免疫吸附治療療效至關(guān)重要?；颊呤欠翊嬖谛募∫种菩宰陨砜贵w，在臨床上無法判定［8］。即使用培養(yǎng)心肌細(xì)胞的測定也不能作為免疫吸附治療的篩選方法，僅僅是因?yàn)橹匕Y患者就使用免疫吸附療法的話，治療無效的病例將會(huì)增加。日本在世界上首先建立簡便有效的體外實(shí)驗(yàn)［6］。他們將患者血清加入雞受精卵后用心臟超聲測定雞LVEF，若存在心肌自身抑制性抗體，LVEF則下降。104例擴(kuò)張型心肌病患者的測定結(jié)果表明65.9%存在心肌自身抑制性抗體［6］。

我們用心臟超聲測得的生理鹽水組LVEF值均數(shù)±2SD作為正常范圍，發(fā)現(xiàn)冠心病心力衰竭組不存在心肌抑制性抗體，對(duì)雞胚心臟LVEF無抑制作用，與生理鹽水組相同。而36例擴(kuò)張型心肌病心力衰竭患者中有23例(63.9%)患者血清IgG對(duì)雞胚心臟LVEF有抑制作用，明顯低于生理鹽水組和冠心病心力衰竭組(P＜0.01)，與日本報(bào)道的相似。提示這些患者可能通過吸附體內(nèi)的心肌抑制性抗體，減少其對(duì)心肌的免疫損傷，使心功能獲得改善。而在本研究中擴(kuò)張型心肌病的心力衰竭患者是否存在心肌抑制性抗體，無論在年齡、性別和心力衰竭的嚴(yán)重程度上，兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究還發(fā)現(xiàn)心肌抑制抗體陽性的擴(kuò)張型心肌病組雞胚的心率也明顯高于心肌抗體陰性組，提示該抗體除了對(duì)心肌收縮功能有明顯影響外，對(duì)雞胚心臟的β受體也有作用，但不能排除心室率增快與LVEF降低有關(guān)。

本研究選擇18 d齡的雞胚用作檢測是否存在抗心肌抗體。首先是因?yàn)樾募∫种菩钥贵w屬于IgG類抗體，可以透過雞胚卵圓空氣囊的半透膜進(jìn)入雞胚的血液循環(huán)，抑制雞胚心臟的收縮功能。其二是由于18 d齡的雞胚各個(gè)臟器已經(jīng)發(fā)育成熟，心臟的舒縮在超聲下清晰可見，時(shí)間過早雞胚尚未成熟，雞胚心臟難以測定，過晚雞胚開始破殼進(jìn)行肺呼吸而影響心臟超聲檢測。此外，雞胚來源充足，價(jià)格低廉，雞胚心臟抑制實(shí)驗(yàn)操作簡單，無需特殊設(shè)備或條件，而且重復(fù)性好。

雞胚心臟抑制試驗(yàn)可用作免疫吸附治療前確定擴(kuò)張型心肌病患者是否存在心肌自身抑制性抗體的篩選方法，也可作為免疫吸附治療后心肌抑制性抗體是否轉(zhuǎn)陰的簡便易行檢測方法。

［1］Wang LM，Chen QS，Xia F．Enzyme-linked immunosorbentassay for the quantitative determination of N-terminal pro-brain natriuretic peptide in serum and its clinical application．JMod Lab Med，2007，22:19-21．(in Chinese)汪隆海，陳啟松，夏芳．N末端腦鈉肽的定量ELISA法測定與臨床應(yīng)用．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22:19-21．

［2］Hare JM．The dilated，restrictive，and infiltractive cardiomyopathies．In:Libby，Bonow RO，Mann DL，Zipes DP，ed．Braunwald's Heart Disease，8th ed，W．B．Saunders，Philadelphia，2008，p1746．

［3］Okazaki T，Tanaka Y，Nishio R，et al．Autoantibodies against cardiac troponin I are responsible for dilated cardiomyopathy in PD-1-deficientmice．Nat Med，2003，9:1477-1483．

［4］Jahns R，Boivin V，Hein L，et al．Direct evidence for a beta aadrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy．J Clin Invest，2004，113: 1419-1429．

［5］馬場彰泰，村山章，若林靖久．拡張型心筋病患者の免疫吸著療法に有效な吸著カラムの同定．日本マフェレシス學(xué)會(huì)雜志，2004，23:101-102．

［6］Baba A．Autoantigen estimation and simple screening assay against dilated cardiomyopathy．Ther Apher Dial．2008，12:109-116．

［7］Wallukat G，Reinke P，Dorffel WV，et al．Removal of autoantibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption．Int JCardiol，1996，54:191-195．

［8］Liu PP，Schultheiss HP．Myocarditis．In:Linbby P，Bonow RO，Mann DL，Zipes DP，ed．Braunwald's Heart Disease，8th ed，W．B．Saunders，Philadelphia，2008:1790．

Evaluation of chickembry osleftventr iculare jectionf ractionf or detecting cardiode pressant autoantibodies inpatients with dilatedcardiomy opathy

PANWei-min1，ZHUYun-yun1，XUYou-feng2，CHENXiao-min1，CHENLi-bin2，ZHANGZhao-xia1，ZHANGSheng-min2，YUFei2，SUNDinghe3，WENGYue-song3.1Department of Cardiology，Ningbo FirstHospital，Ningbo315010，China;2 Department of Ultrasound;3Department of Laboratory Medicine

PANWei-min，Email:weimin-pan@sinacom

ObjectiveTodete ctcardiod epressant autoant ibodies inpatients with dilated cardiomyopathy(DCM)and heartfailure(HF)bychickembry osleftventricul are jection fraction(LVEF) evaluation.MethodsThirty-sixpatient with DCM and HF(DCMgroup)and 23coronary heartdisease patients with HF(non-DCMgroup) wereenrolled. Cardiode pressant antibodies weredeter minedby chick embryo LVEF evaluation afteradding thepatients'purified immunog lobulin Gto18-day-oldchickembryos.ResultsMean LVEFinnon-DCMgroupwas81.03%±2.67%.Mean LVEF of 13cases in DCM group with negativeantibody was 81.24%±2.33% and 62.04%±2.98% of 23cases in DCM group with positive antibody.ConclusionsCardiodepressant antibodiesmay bepresentin 63.9% of thepatients with DCM.

Dilatedcardio my opathy;Heart failure;Cardiode pressant autoantibody;Chick embryo;Ultrason icechocar diography

2012-02-28)

(本文編輯:周白瑜)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.014

寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009A610178)

315010寧波市第一醫(yī)院心內(nèi)科(潘偉民、朱云云、陳曉敏、章朝霞)，超聲科(許幼峰、陳立斌、張盛敏、俞霏)，檢驗(yàn)科(孫定河、翁躍頌)

潘偉民，電子信箱:weimin-pan@sina．com